[发明专利]一种可用于检测猪圆环病毒2型抗体的Cap抗原的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及Cap抗原的制备方法，更具体地，涉及可用于检测猪圆环病毒2型抗体的可溶性Cap抗原的制备方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属圆环病毒科(circoviridae)圆环病毒属，是无囊膜的单股环状负链DNA病毒，是迄今已知的最小的动物病毒之一。Tischer(1974)等首先在猪肾细胞系PK-15中发现了PCV。根据PCV的抗原性及基因组成不同，将其分为两种基因型(或称血清型)，即PCV1和PCV2。PCV1无致病性，广泛存在于猪体内及猪源传代细胞系；PCV2具有致病性，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(Post-weaningmultisystemic wasting syndrome，PWMS)的主要病原之一。

PCV2是近年来新发现的猪的传染病之一，患病仔猪出现腹泻、发烧、躯体震颤、渐行性消瘦，最后死亡。康复猪常变成僵猪，失去饲养价值。繁殖母猪感染则出现繁殖障碍，产仔出现死胎，严重的失去繁殖能力。该病主要导致猪体的免疫抑制，从而继发或并发其它疾病，如猪繁殖与呼吸道障碍综合征(PRRS)和细小病毒(PPV)病，给养猪业造成巨大的经济损失。

在我国，郎洪武等(2000)采集了来自北京、河北、上海、天津、江西、吉林和河南等7个省(直辖市)22个猪群的559份血清，结果显示PCV2抗体总阳性率为42.9％，并随猪龄的增长而升高，表明我国猪群中存在PCV2感染。曹胜波等(2001)通过对PCV2 DNA序列分析证实，中国的分离株与国外分离株的同源性并不高，由此推断PCV2在我国已经流行多年，且病毒发生了变异。

目前还没有用来预防该病的疫苗，也缺乏有效的治疗药物，给该病的防控造成了很大的困难，因此PCV2的早期诊断就显得尤为重要。PCV2诊断主要采取的方法有病原学方法和血清学方法。其中病原学诊断方面以PCR法为最为常见。PCR法要求苛刻的试验条件，加之费用昂贵，限制了其大规模推广。

鉴于PCV2病毒对养猪业健康发展的巨大危害，开发操作简单、结果可靠、敏感性高、特异性好、方便基层应用的可以产业化生产的血清抗体检测方法是预防PCV2传播的可靠途径之一。

PCV2基因组含有11个阅读框，其中两个较大的阅读框ORF1和ORF2分别编码病毒复制的相关蛋白(Rep，位于正链)和结构蛋白(Cap，位于负链)。Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白，构成病毒的核衣壳。血清学试验显示，PCV1和PCV2的Cap蛋白没有抗原交叉性，PCV2的Cap蛋白可有效区分PCV1和PCV2感染的血清抗体。

酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)适用于PCV2感染的大规模血清学调查及流行病学调查，为PCV2相关的疾病诊断奠定了基础。Nawagitgul(2002)等报道了两种间接ELISA方法。一种以细胞培养的PCV2全病毒作为抗原(PCV2 ELISA)，另一种以重组杆状病毒表达PCV2 Cap(衣壳蛋白，由病毒基因组中ORF2编码)蛋白作为抗原(Cap ELISA)，分别用于检测PCV2感染后的血清抗体。以PCV2全病毒作为抗原建立的ELISA不能有效区分PCV1与PCV2抗体，并且PCV2病毒培养物滴度低，纯化困难，因此该方法的应用受到了很大限制。

以PCV2 Cap蛋白作为抗原建立的ELISA可将血清中PCV1与PCV2抗体很好地区分开来。大肠杆菌是目前应用最广泛，技术操作最成熟的表达系统，但是外源性蛋白在其中主要以无生物学活性的包涵体形式存在，需要复杂的变性、复性过程以恢复蛋白活性，同时复性率往往低于30％，严重影响了目标蛋白的研究和应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是在大肠杆菌中表达产生生物学活性良好的可溶性rCap蛋白，通过改变常规的诱导表达条件和培养基成分，从而达到减少包涵体的形成的目的，避免复杂的变性、复性过程，进而开发出操作简单、结果可靠、敏感性高、特异性好的血清抗体检测方法及装置。