[发明专利]多靶点miRNA反义核苷酸技术

说明书

技术领域

本发明涉及一种反义核苷酸技术。 

背景技术

反义核苷酸是一段与mRNA或DNA特异性配对结合从而阻断其基因表达的人工合成的RNA或DNA分子。反义核苷酸能通过封闭或抑制肿瘤细胞和病毒的关键编码基因来特异性抑制细胞增殖和病毒的复制，是治疗肿瘤、病毒性疾病和其它相关疾病的新型药物。目前正在进行研究的反义核苷酸药物有10余种，其中抗肿瘤作用的有7种，抗病毒作用的1种，其它如作用于心血管、代谢、免疫及细胞粘附系统的有4种。疾病的发生，往往是几个或多个基因综合作用的结果，目前这些反义核苷酸药物设计均是针对某个单一致病基因或某个调节病毒基因蛋白表达(酶)的关键序列来设计的。微RNAs(miRNAs)的发现改变了我们对调节基因表达机制的理解。根据miRNAs在基因组中的数量(预计在人类基因中含量＞1％，调节1～10％的基因)和表达水平(一些miRNAs在每个细胞中的拷贝数＞1000)说明miRNAs在人体内是一种含量丰富的RNA种类。而且每个miRNA具有调节数百个mRNAs的潜能；因此miRNAs在细胞中有广泛的功能。目前已证明包括癌症在内的一系列人类疾病中miRNAs是这些疾病新的治疗靶点。因此，沉默miRNAs最有效的途径是利用miRNA的反义核苷酸。根据疾病中miRNAs功能变化针对性的设计反义核苷酸药物进行干预，这是在miRNAs研究和miRNAs治疗中一种基本的途径。这些miRNA反义核苷酸的结合具有特异性、剂量依赖性，有效性和不可逆性。这个方法已被用来鉴定miRNAs的许多细胞学功能，且人们已经相信它是治疗疾病的一种合理的对策。目前沉默miRNAs的主要方法为Anti-miRNA反义抑制剂(Anti-miRNA antisense inhibitors or anti-miRNA oligonucleotides，AMO)方法，但该方法存在靶向性单一，作用效力差的问题。 

发明内容

本发明是为了解决现有沉默miRNAs的方法存在靶向性单一，作用效力差的问题，而提出了多靶点miRNA反义核苷酸的制备方法。多靶点miRNA反 义核苷酸的制备方法通过以下方法实现：一、通过基因芯片筛选或文献提供，找到可调节关键基因的miRNA；二、根据所选定的多个靶miRNA，人工合成所选定靶miRNA各自的反义核苷酸链，称为反义单元；三、将不同的靶miRNA的反义单元设计到一个能同时沉默多个靶miRNAs的单条核苷酸序列中，即用一条八个核苷酸的链来连接两个不同目标miRNA的反义单元，其中八个核苷酸的链的两端分别连接于两个不同的目标miRNA的反义单元的5’端和3’端，反义单元两端的五个核苷酸由亚甲基桥锁定，八个核苷酸的链为CTTAAATG，即实现多靶点miRNA反义核苷酸的方法。本发明将针对不同miRNA为靶标的多个反义核苷酸整合到单一核苷酸片段中，这种片段对miRNAs具有多靶向性——复合miRNAs(combined anti-miRNA oligonucleotides，CAMO)，它是寻找miRNAs靶点和研究miRNAs功能的一种改良途径，这主要是由于CAMO的“单片段-多靶点”方法可以是携带重复的同一反义单元的同型体或者是携带多种靶向不同miRNA的反义单元的异型体。由于一个特定的mRNA被多种miRNA调节，为了获得基因的最佳干扰效果需要同时靶向多种miRNA，而本发明可以做到这一点，这是CAMO方法优于AMO方法之处。由于不同目的需要多种不同反义单元集合的组合，CAMO为此提供了一个具有创新和理性设计的方法，为确认和鉴别miRNA的靶点和它们在基因调控过程中的作用等功能分析中提供了一种精密的工具。本发明可以作为一种简单而直接的方法，可对其它包含多种miRNA及多种基因的生物过程进行研究。CAMO方法与现有方法相比较其最大优势在于，可以使一个药物分子调节多个靶向基因，作用效果更加显著，解决了现有方法靶向性单一，作用效力差的问题。 

附图说明