[发明专利]利用研磨法从凝胶中纯化小片段DNA的方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种利用研磨法从凝胶中纯化小片段DNA的方法和用途。

背景技术：

分离纯化DNA是基因工程领域中的一项基本技术，目前，DNA回收的主要方法是通过凝胶电泳分离DNA片段，然后切割含有目的片段的凝胶，在NaI的作用下溶解凝胶，然后过柱或玻璃株回收DNA。该方法对分离分子量DNA是非常有效的，然而，DNA的回收得率是和DNA的分子量相关的，当DNA的分子量在合适的范围时可以得到很高的回收率；当分子量大于20kb时，回收率只有20％左右，同样的对于小分子量DNA，其回收效率也是很低的，尤其是分子量少于100bp的片段，甚至不能得到目的片段，不能满足常规实验的要求。

目前有多家生物公司开发了可用于回收DNA的试剂盒，这些试剂盒对一般分子量大小的DNA是有效的，但因自身缺陷而对于小分子量DNA回收效率低下，甚至不能得到目的片段。本发明提供了一种高得率小分子量DNA的回收方法，该方法尤其适合于回收分子量低于100bp的DNA片段，而且对大分子量DNA的回收同样有效。同时该方法可用于回收PCR产物、小片段DNA或小分子量肽，以及用于提高表达产量而构建的多基因串连产物。

发明内容：

本发明针对现有对小分子量DNA回收技术的缺陷，提供一种用研磨法从凝胶中高效纯化小片段DNA的方法和用途。

利用研磨法从凝胶中纯化小片段DNA的方法包括如下步骤：

1)在回收包含PCR或酶切产生的小分子量DNA片段的高浓度凝胶中，加入400～800μl 0.1倍TE缓冲液或灭菌水，用匀浆器研磨破碎，10000～12000rpm离心5～10分钟，取上清；

2)在上清液中加入1/3体积pH为5.2的3MNaAc和2倍体积的无水乙醇，或者0.6倍体积的异丙醇，以沉淀DNA；10000～12000rpm离心5～10分钟，弃上清；

3)用600～1000μl 70％的冷乙醇洗涤DNA沉淀，10000～12000rpm离心3～5分钟，弃上清；

4)真空抽干DNA沉淀，让残留的乙醇挥发干净，将DNA沉淀溶解在0.1倍TE缓冲液或灭菌水中，-20℃保存。

所述的小分子量DNA片段小于100bp。

纯化的小分子量DNA用于克隆、转化、转染、DNA疫苗接种和/或PCR反应。

本发明具有如下优点：

1.本发明凝胶磨碎采用匀浆器，免去了酚/氯仿等有害物质的污染；

2与其他类似的DNA纯化试剂盒相比，本发明可以有效的从凝胶中纯化分子量低于100bp的DNA片段，提高了小分子量DNA的回收效率，同样，本发明也可有效的回收分子量大于100bp的DNA片段；

3.本发明为需要回收小分子量DNA的克隆、转化、基因转导、突变检测、基因诊断和治疗等研究和应用提供了一种新的手段和方法。

附图说明

图1为DNA的凝胶电泳图，是本发明所用方法与其他公司试剂盒纯化DNA之间的比较；图中：泳道1、2、3为试剂盒纯化DNA，分子量分别为72、98、225bp；泳道4为50bpDNA分子量Marker；泳道5、6、7为本发明方法纯化分子量为72、98、225bp DNA。

与参考DNA相比由本方法纯化的小分子量DNA得率明显高于对照。显然，本方法与其他试剂盒提取DNA相比，显著提高了纯化效率。

图2为本发明纯化的DNA进行常规连接、转化后挑取单克隆进行PCR鉴定的凝胶电泳图；图中：泳道1为50bpDNA分子量Marker；泳道2、3、4为分子量为72、98、225bp的PCR产物。

具体实施方式

本发明以匀浆器研磨破碎电泳结束后切割的带有目的条带的凝胶，使凝胶中的小分子量DNA释放到缓冲液中，在离心力的作用下实现DNA与凝胶的分离；在通过盐离子和有机溶剂的作用使DNA沉淀下来，从而实现对小分子量DNA的高效纯化，建立一种新的基于匀浆器研磨的小分子量DNA的快速高效纯化方法。

实施例1

1)在回收包含70bp DNA PCR产物的高浓度凝胶中，加入400μl 0.1倍TE缓冲液或灭菌水，用匀浆器研磨破碎，10000rpm离心10分钟，取上清；

2)在上清液中加入1/3体积pH为5.2的3M NaAc和2倍体积的无水乙醇，或者0.6倍体积的异丙醇，以沉淀DNA；10000rpm离心10分钟，弃上清；

3)用600μl 70％的冷乙醇洗涤DNA沉淀，10000rpm离心5分钟，弃上清；