[发明专利]一种甘蔗脱毒组培快繁的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物脱毒组培快繁技术领域，尤其涉及一种甘蔗脱毒组培快繁的方法。

背景技术

甘蔗花叶病害在浙江和福建等省广泛发生已有多年，新叶呈现浅黄色斑驳或轻微的褪绿条纹，老叶呈现长条褪绿条纹或花叶，发病率很高，造成糖分和产量下降(约18％左右)，种性也衰退，影响品质。

获得无病毒植株的方法有多种，例如热处理脱毒、茎尖培养脱毒和茎尖微嫁接脱毒以及组合方法。其中普遍采用的较好的方法是茎尖培养脱毒法，具体的步骤是：通过植物顶端分生组织切取茎尖(0.2mm以下分生组织)，诱导产生幼芽，长成小植株得到脱毒苗。相关的技术已有许多的专利。例如，CN1031637A、CN1238122A、CN1258435A、CN1258436A披露了采用茎尖作为外植体，经茎尖培养后得到脱毒苗的方法。但是这种茎尖分生组织脱毒法存在的问题是：要切取很微小的0.2mm以下茎尖分生组织，需在显微镜下操作，具有一定难度；而且，切取茎尖组织越小，成活率就越低，而切取茎尖组织偏大，又不能完全脱除病毒，同时容易造成污染；因此，生产上迫切需要一种更好的方法来满足甘蔗脱毒组培快繁的需要。

发明内容

本发明目的是针对上述茎尖分生组织脱毒法所存在的操作难度大、成活率低等缺陷，提出一种以切取较大的甘蔗植株茎尖(2～3mm)为外植体，先诱导产生愈伤组织，再分化形成植株的方法，达到大量、快速、操作方便、脱毒彻底地繁殖甘蔗脱毒组培苗的目的。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

一种甘蔗脱毒组培快繁的方法，按如下步骤进行：

1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：

(1)基本培养基：用MS培养基，蔗糖或白糖20～30g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～5.8；

(2)愈伤组织诱导培养基：MS中添加2，4-D 1～2mg/L和NAA 0.1～0.2mg/L；

(3)分化培养基：MS中添加6-BA2.0～3.0mg/L和NAA 0.1～0.3mg/L；

(4)增殖培养基：MS中添加6-BA0.5～1.0mg/L和NAA0.1mg/L；

(5)生根培养基：1/2MS中添加NAA0.1～0.5mg/L；

2)外植体的选取与灭菌：取甘蔗的顶芽或腋芽，经灭菌处理，作为脱毒组培用的外植体；

3)愈伤组织诱导培养：将步骤2)灭菌处理后的顶芽或腋芽在无菌条件下，摘取其2～3mm的茎尖组织，接种在愈伤组织诱导培养基上，诱导形成愈伤组织；

4)分化培养：将步骤3)诱导形成的愈伤组织移植至分化培养基分化出丛芽；

5)增殖培养：将步骤4)分化的丛芽切成单株接种在增殖培养基上，再分化出丛芽；

6)生根培养：将步骤5)增殖形成的丛芽切成单株接种在生根培养基中进行生根培养；

7)移栽：当步骤6)的生根组培苗生长至3～5cm，根数5根以上时，移栽基质培养至成苗；

8)病毒检测：利用RT-PCR扩增技术，构建其基因组序列克隆，原核表达制备病毒特异性的抗血清，建立ELISA检测技术进行甘蔗花叶病毒检测。

所述的培养基进一步可改进为，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：

(1)基本培养基：用MS基本培养基，白糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8；(2)愈伤组织诱导培养基：MS+2，4-D 1.5mg/L+NAA 0.15mg/L；(3)分化培养基：MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 0.15mg/L；(4)增殖培养基：MS+6-BA 0.75mg/L+NAA 0.1mg/L；(5)生根培养基：1/2MS+NAA 0.25mg/L。

所述的灭菌处理是将外植体先经75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用0.1％升汞溶液灭菌10～15min，最后用无菌水冲洗3～5次。

所述的移栽基质是泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比3∶1∶2配制而成。本发明的有益效果是：

1)本发明利用甘蔗的顶芽和腋芽为脱毒组培的外植体，由于茎尖培养时摘取其2～3mm长的茎尖组织，体积较大接种操作就较容易；接种成功率高达90％以上，而现有以脱毒为目的仅摘取0.2～0.3mm的茎尖组织，其培养接种成活率一般只有20％～40％；