[发明专利]牛奶样品布氏杆菌套式PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因工程技术，具体为牛奶样品布氏杆菌的套式PCR检测方法。

背景技术

布氏杆菌病(Brucellosis)又称马尔他热或波状热，是由布氏杆菌属(Brucella)引起的人畜共患的自然疫源性传染病，对人类健康和畜牧业生产都有严重危害，1859年由Morston首次报道。布氏杆菌可感染人类、多种家畜和野生动物，引起相似的临床症状与病理损伤，如发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损害等，可导致巨大的经济损失和严重的公共卫生问题。家畜布氏杆菌病常发于猪、羊和牛，是人类布氏杆病的主要传染源。布氏杆菌传染性强、传播迅速，世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类动物疫病，我国列为二类动物疫病。1995年以来，我国人畜布氏杆菌疫情明显回升，2000年以后开始呈快速增长趋势，局部地区甚至出现爆发，卫生部统计数据显示1994年布病新发病人数为815人，发病率0.05/10万，到2005年新发病人数已经接近2万人，发病率高达1.41/10万，比2004年增加60.2％，疫情形势十分严峻。

布氏杆菌病是国际贸易检疫中必检的传染病，我国每年均开展对奶牛的布氏杆菌病的普查和监控。目前，我国所采用的布氏杆菌检测技术包括虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)和补体结合试验(CFT)等，均不能适应现代检验检疫需求。RBT和SAT等凝集试验虽然操作简便、耗时短，但存在假阳性反应，OIE已取消其作为布氏杆菌病的检测方法；CFT则操作繁琐，实验条件和技术水平要求高，无法在基层单位开展。因此，迫切需要建立新型的快捷、简便的检测方法。酶联免疫吸附试验(ELISA)具有很高的特异性和敏感性，用于检测布氏杆菌特异性抗体，但不能将疫苗免疫与致病菌感染的抗体相区别。在病原检测方面，针对布氏杆菌保守基因(如BCSP31、16S rRNA)的PCR检测方法相继建立，但多限于对布氏杆菌纯培养物或提纯染色体DNA的实验室检测，并显示不同的敏感性(20-100CFU/mL或8fg-20pg)，尚未建立对临床样品(特别是牛奶及其制品)的检测技术，远不能满足动物布氏杆菌病检验检疫和监控的实际需求。由于牛奶及其制品中存在大量乳脂和蛋白质等多种非特异性影响因素，严重影响牛奶样品细菌染色体DNA的提取效率，因此直接从牛奶样品检测布氏杆菌DNA存在较大难度。

发明内容

本发明的目的是提供直接从牛奶样品中直接检测布氏杆菌的套式PCR检测方法，为奶牛布氏杆菌病普查和监测，以及牛奶制品的食品安全监控提供新的技术手段。

本发明所建立的牛奶样品布氏杆菌套式PCR检测方法，可以套式PCR引物直接从牛奶样品中检测布氏杆菌特异性DNA片段。

用3.4％十二烷基磺酸钠(SDS)裂解牛奶样品沉淀，经1mg/mL蛋白酶K和RNaseA消化，以优化的CTAB-NaCl法提取牛奶样品细菌染色体DNA，以套式PCR引物直接从牛奶样品中检测布氏杆菌特异性DNA片段。套式PCR引物的外向引物为：5’-TCGAGCGCCCGCAAGGGG-3’和5’-AACCATAGTGTCTCCACT AA-3’，内向引物为：5’-ATCGGCAAATGATCGGCC-3’和5’-TACTCCCCAGGCGGAATG TT-3’，分别扩增903bp和628bp布氏杆菌16S rRNA特异性DNA片段。

本发明的详细步骤如下：

(1)将牛奶样品沉淀用NET溶液悬浮，在悬浮液中加入10％十二烷基磺酸钠(SDS)，至终浓度为：SDS重量占悬浮液体积的3.4％(w/v)，裂解牛奶样品沉淀，获牛奶样品裂解液；

(2)在每毫升牛奶样品裂解液中加入1毫克蛋白酶K和1毫克RNaseA消化，获牛奶样品裂解消化液；

(3)以CTAB-NaCl法从牛奶样品裂解消化液中提取牛奶样品细菌染色体DNA；

(4)用套式PCR引物直接从牛奶样品细菌染色体DNA中检测布氏杆菌特异性DNA片段。

套式PCR引物的外向引物为：5’-TCGAGCGCCCGCAAGGGG-3’和5’-AACCATAGTGTCTCCACT AA-3’，内向引物为：5’-ATCGGCAAATGATCGGCC-3’和5’-TACTCCCCAGGCGGAATG TT-3’，分别扩增903 bp和628 bp布氏杆菌16S rRNA特异性DNA片段。