[发明专利]牛奶样品布氏杆菌套式PCR检测方法无效
| 申请号： | 200710070130.2 | 申请日： | 2007-07-20 |
| 公开（公告）号： | CN101100693A | 公开（公告）日： | 2008-01-09 |
| 发明（设计）人： | 周继勇;郭军庆;杜振昆 | 申请（专利权）人： | 浙江大学 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12Q1/04 |
| 代理公司： | 杭州中成专利事务所有限公司 | 代理人： | 冯子玲 |
| 地址： | 310029浙江省杭州市江干区*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 牛奶 样品 杆菌 pcr 检测 方法 | ||
1.一种牛奶样品布氏杆菌套式PCR检测方法，其特征在于以下步骤：
(1)将牛奶样品沉淀用NET溶液悬浮，在悬浮液中加入10％十二烷基磺酸钠(SDS)，至SDS在悬浮液的终浓度的重量体积比为3.4％，裂解牛奶样品沉淀，获牛奶样品裂解液；
(2)在每毫升牛奶样品裂解液中加入1毫克蛋白酶K和1毫克RNaseA消化，获牛奶样品裂解消化液；
(3)以CTAB-NaCl法从牛奶样品裂解消化液中提取牛奶样品细菌染色体DNA；
(4)用套式PCR引物直接从牛奶样品细菌染色体DNA中检测布氏杆菌特异性DNA片段。
2.根据权利要求1所述的牛奶样品布氏杆菌套式PCR检测方法，其特征在于：套式PCR引物的外向引物为：5’-TCGAGCGCCCGCAAGGGG-3’和5’-AACCATAGTGTCTCCACTAA-3’，内向引物为：5’-ATCGGCAAATGATCGGCC-3’和5’-TACTCCCCAGGCGGAATGTT-3’，分别扩增903bp和628bp布氏杆菌16S rRNA特异性DNA片段。
3.根据权利要求1所述的牛奶样品布氏杆菌套式PCR检测方法，其特征在于：步骤(3)所述CTAB-NaCl法提取牛奶样品细菌染色体DNA的具体操作为：在每毫升牛奶样品裂解消化液中加入5M的NaCl溶液0.14毫升，混合后加入含10％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和0.7M NaCl的预热至65℃的CTAB-NaCl水溶液，使CTAB在提取液中的终浓度的重量体积比为3.4％，NaCl在提取液中的终浓度为0.7M；再经氯仿抽提和异丙醇沉淀，沉淀物用超纯水溶解，获牛奶样品细菌染色体DNA。
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