[发明专利]海产甲壳类寄生血卵涡鞭虫的PCR检测方法

说明书

                   技术领域

本发明公开了一种对海产甲壳类动物寄生血卵涡鞭虫的PCR检测方法，适用于梭子蟹、锯缘青蟹、海水龙虾、日本蟳等海产甲壳类血卵涡鞭虫病的检测，属于水产养殖动物疾病的检测技术。

                   技术背景

血卵涡鞭虫(Hematodinium)是一类危害海水甲壳动物的重要病原性寄生虫，具有很强的致病性，可引起挪威龙虾(N.norvegicus)、兰蟹(C.Sapidus)、白氏雪蟹(C.bairdi)以及蛛雪蟹(C.opilo)等许多重要经济甲壳类发病，并导致规模性死亡，由于其宿主和流行范围广、死亡率高、危害非常严重。2005年我们首次从养殖梭子蟹中发现该寄生虫病原，并进一步证实其是引起养殖梭子蟹规模性死亡重大疾病“牛奶病”的主要病原之一，继后又在养殖锯缘青蟹、海捕日本蟳等其他海产甲壳类当中检测到该寄生虫病原。至今尚缺少该寄生虫病原研究报道，对该寄生虫的许多基础研究尚属空白，特别是缺少有关该寄生虫的检测技术，为该寄生虫疾病的预防和控制带来了困难。

                     发明内容

为克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种血卵涡鞭虫的PCR检测方法，以实现对血卵涡鞭虫的准确检测，为预防和控制该病的发生，为健康养殖提供科学的依据。PCR是一种具有敏感性高、特异性强的靶DNA的快速检测方法，能实现病原的快速、正确检测，样品中即使含有少量的病原DNA，即能检出。

为了实现上述本发明的目的，本发明所建立的血卵涡鞭虫PCR检测方法包括下列步骤：

1)样品处理：取检测样品肌肉组织100～500mg，用0.7～1mL试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀；每分钟10000～12000转离心2～5min；或取检测样品血淋巴300μL，每分钟8000转离心5min；弃上清，用500μL试剂A悬浮样品。

2)DNA提取：取500μL上述样品处理液，加入100μL试剂B混匀，在55℃浴中保温30～120min，期间不断混匀；加入等体积的酚/氯仿抽提，每分钟12000转离心10min，取上清并加入上清体积2倍的无水乙醇沉淀DNA，室温放置5～10min；每分钟12000转离心5～10min；弃上清，75％乙醇洗涤沉淀1～2次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于30～50μL灭菌双蒸水中，即为DNA提取液，-20℃保存备用。

3)反应体系：在PCR试剂管中加入0.5～1μL上述的DNA提取液，每管加入2.5U/μL的Taq酶0.5～1.0μL，每分钟3000～5000转离心2～5s混匀，置于PCR试管内进行扩增。

4)扩增条件：

通过94℃解链5min；然后94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，如此进行循环35次；最后72℃延伸10min，得扩增物。

5)PCR扩增物分析：

取5～10μL扩增后的样品，与1～4μL 0.25％(w/v)溴酚蓝上样缓冲液混合，在含0.5μg/mL溴化乙锭的1％(w/v)琼脂糖中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察。

6)判断标准：

若样品孔有一条586bp核酸条带为有血卵涡鞭虫感染或污染的阳性样品，没有显示该核酸条带为阴性未感染。

其中所述的：

试剂A成分为：0.5M NaCl，50mM Tris(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)；

试剂B成分为：20mg/mL蛋白酶K、10％SDS；

PCR试剂管成分为2.5～5.0μL 10 x buffer，2.0～4.0μL dNTP(为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度2.5mM)，1.5～3.0μL25mM MgCl₂，0.25～0.5μL 25μM引物1，0.25～0.5μL 25μM引物2，17.5～35μL灭菌去离子水。

PCR试剂成分最佳组成为：5.0μL 10 x buffer，1μL 2.5U/ul Taq酶，4.0μLdNTP，3.0μL 25mM MgCl₂，0.5μL 25μM引物1，0.5μL 25μM引物2，35μL灭菌去离子水：其中dNTP为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度2.5mM。