[发明专利]海产甲壳类寄生血卵涡鞭虫的PCR检测方法

权利要求书

1.一种海产甲壳动物类寄生血卵涡鞭虫的PCR检测方法，其特征在于包括下列操作步骤：

1)样品处理：取检测样品肌肉组织100～500mg，用0.7～1mL试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀；每分钟8000～12000转离心2～5min；或取检测样品血淋巴300μL，每分钟8000转离心5min；弃上清，用500μL试剂A悬浮样品。

2)DNA提取：取500μL上述样品处理液，加入100μL试剂B混匀；再在55℃水浴中保温30～120min，其间不断混匀；加入等体积的酚/氯仿抽提，每分钟12000转离心10min；取上清并加入上清体积2倍的无水乙醇沉淀DNA；室温放置5～10min，每分钟10000～12000转离心5～10min；弃上清，75％乙醇洗涤沉淀1～2次，让乙醇彻底挥发，将其沉淀溶于30～50μL灭菌双蒸水中，即为DNA提取液，-20℃保存备用。

其中所述的：

试剂A成分为：0.5M NaCl，50mM Tris，10mM EDTA；Tris和EDTA pH均为8.0；

试剂B成分为：20mg/mL蛋白酶K、10％SDS；

3)PCR：在PCR试剂管中加入0.5～1μL上述的DNA提取液，每管加入2.5U/μL的Taq酶0.5～1.0μL，每分钟3000～5000转离心2～5s混匀，置于PCR试管内进行扩增；通过94℃解链5min；然后94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，如此进行循环35次；最后72℃延伸10min，得扩增物。

其中所述PCR试剂管成分为2.5～5.0μL 10×buffer，2.0～4.0μL dNTP(为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度2.5mM)，1.5～3.0μL 25mM MgCl₂，0.25～0.5μL 25μM引物1，0.25～0.5μL 25μM引物2，17.5～35μL灭菌去离子水；所述的上游引物1和下游引物2分别是由DNA合成仪按碱基序列为：上游引物1：5’-CTGATTACGTCCCTGCCCTT-3’；下游引物2：5’-GCATGTCGCTGCGTTCTTC-3’合成的DNA片段。

4)PCR扩增物分析：取5～10μL扩增后的样品，与1～4μL0.25％(w/v)溴酚蓝上样缓冲液混合，在含0.5μg/mL溴化乙锭的1.0％(w/v)琼脂糖中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，样品孔有一条586bp核酸条带，为有血卵涡鞭虫感染或污染的阳性样品。

2.根据权利要求1所述一种海产甲壳动物类寄生血卵涡鞭虫的PCR检测方法其特征在于：PCR试剂成分最佳组成为：5.0μL 10×buffer，1μL2.5U/μLTaq酶，4.0μL dNTP，3.0μL 25mM MgCl₂，0.5μL 25μM引物1，0.5μL 25μM引物2，35μL灭菌去离子水；其中dNTP为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度2.5mM。