[发明专利]基因重组毕赤酵母生产耐高温木聚糖酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因重组毕赤酵母生产耐高温木聚糖酶的方法。

背景技术

木聚糖是植物半纤维素的重要组分，主要存在于植物的细胞壁中，约占细胞干重的35％，是自然界中除纤维素外最丰富的多糖，也是一种巨大的可再生资源。但麦类(如小麦、黑麦、稻谷、麸皮、米糠等)饲料中的木聚糖作为非淀粉多糖抗营养因子对动物的消化和吸收有很强的抗营养作用。主要表现为：在动物胃肠道中与营养物质粘性结合，降低营养成分的吸收；结合消化酶和胆汁酸，影响消化，增加排粪量，粘粪增多，污染环境；导致动物胃肠道中微生物繁殖增多，并对畜禽产品品质造成不利影响。

因此，开发和利用麦类谷物和糠麸等丰富资源的最关键问题是消除饲料中的抗营养因子。在这些饲料中添加木聚糖酶(主要是内切-β-1，4-木聚糖酶)可以有效降解木聚糖，削弱甚至消除其抗营养作用，提高饲料的利用率，降低空气中氨气和硫化物的浓度，减轻污染，促进动物的健康。因此，木聚糖酶对于开发谷物、糠麸类等资源具有十分可观的经济价值、社会意义和生态效益。

木聚糖降解酶是水解木聚糖成为木二糖、木寡糖，以及少量阿拉伯糖和木糖的一种复杂的复合酶系统，广泛存在于自然界的细菌和真菌中，在饲料工业中得到了极广泛的应用。现已成为国内外研究的热点，并取得了很多重要进展，主要包括木聚糖酶的结构和作用机理、酶学和酶应用特性、具优良特性木聚糖酶产生菌株的筛选、通过传统和基因工程手段改良木聚糖酶产生菌以及木聚糖在饲料工业中的应用等方面。

特别是近年来分子生物学技术飞速发展，木聚糖基因工程研究已取得了巨大进展。为了高效表达木聚糖酶和改变其特性以适应商业应用，自1983年Bernier等从Bacillus subtilis PAPII5中最先分离得到木聚糖酶基因至今，国外科技工作者已克隆出百余种木聚糖酶基因，并在原核生物、丝状真菌和酵母等各种宿主菌中得到活性表达。原核表达系统中，重组木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达量一般要比在亲本中低，即便有所提高，其表达的蛋白也难以分泌到培养基中，而是限制在细胞质或周质腔内。从有利于生产及进一步提高表达量水平的角度出发，许多科研工作者尝试利用分泌型的芽孢杆菌、链霉菌、曲霉和酵母菌等作为受体菌来进行表达。目前已报道的表达系统有Streptomyces parullus、Bacillus subtilis、Saccharomycescerevisiae、Pichia yeast、Kluyveromyces lactis、T.reesei、A.niger、A.oryzae等，报道的木聚糖酶最高表达量为20000单位/毫升发酵液。

自1998年以来，分别有芬兰国际公司、丹麦NOVO公司在我国生产并大量推广木聚糖酶，取得了较好的效果。在此期间国内也有不少研究单位和公司开始进行这方面的研究工作，并取得了大量的研究成果，有些产品已进入市场，但目前的产品不论是国内和国外的都不具备耐热特性。颗粒饲料的加工过程中都要经历一个短暂的高温制粒工艺(75-93℃)，一般的木聚糖酶在此高温下会大幅度丧失活性，因此能在饲料中真正推广利用的木聚糖酶必须具有良好的热稳定性；另一方面饲料中的木聚糖酶最终的作用场所是动物正常体温(37℃)的肠胃中，木聚糖酶同时也必须在常温下保持较高活性。因此，如何解决在制粒高温和在动物正常体温下同时具有较高酶活性这一矛盾，已成为目前饲用酶制剂应用的关键性技术环节。

目前，通过基因工程技术对木聚糖酶基因在分子水平上进行改造将是解决这一问题的有效手段，也是今后饲用木聚糖酶发展的趋势和关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因重组毕赤酵母生产耐高温木聚糖酶的方法。它是从黑曲霉(Aspergillus niger var niger strain N402)中分离出木聚糖酶基因，成功实现木聚糖酶基因在真核表达系统毕赤酵母中的高效表达。

本发明是从黑曲霉(Aspergillus niger var niger strain N402)中分离出木聚糖酶基因，在真核表达系统毕赤酵母中高效表达。