[发明专利]基因重组毕赤酵母生产耐高温木聚糖酶的方法

权利要求书

1.一种基因重组毕赤酵母生产耐高温木聚糖酶的方法，其特征在于按以下步骤进行：

1)工程菌的构建：

(1)黑曲霉基因组DNA的提取；

(2)采用PCR反应从黑曲霉基因组DNA中克隆木聚糖酶基因片断，引物和反应条件如下：

引物1(F)：5′-cggaattcgctcctgtgccggaacctg-3′

引物2(R)：5′-cggaattcagaggagatcgtgacactggcgcg-3′

反应条件为：94℃变性1min，50℃复性1min30s，72℃延伸2min30s，30个循环后，72℃保温20min，得黑曲霉木聚糖酶基因序列：

cggaattctggtgtcgcgaagtgctggtattaactacgtgcaaaactacaacggcaaccttggtgatttcacctat

gacgagagtgccggaacattttccatgtactgggaagatggagtgagctccgactttgtcgttggtctgggctggaccactggttcttctaagtga

gtgactgtattctttaaccaaagtctaggatctaacgttttctagcgctatcacctactctgccgaatacagtgcttctggctcctcttcctacctcgctg

tgtacggctgggtcaactatcctcaggctgaatactacatcgtcgaggattacggtgattacaacccttgcagctcggccacaagccttggtaccg

tgtactctgatggaagcacctaccaagtctgcaccgacactcgaactaacgaaccgtccatcacgggaacaagcacgttcacgcagtacttctcc

gttcgagagagcacgcgcacatctggaacggtgactgttgccaaccatttcaacttctgggcgcagcatgggttcggaaatagcgacttcaattat

caggtcatggcagtggaagcatggagcggtgctggc

(3)胶回收DNA片段：取适量PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，用小量柱离心式胶回收试剂盒进行胶回收；

(4)重组酵母表达载体的构建：将克隆得到的木聚糖酶基因片段通过EcoR I位点与表达载体PGAP Zalpha A相连接，构建表达载体PGAP Z alpha-Xyl；

(5)毕赤酵母宿主的转化：重组表达载体通过电穿孔法分别转化毕赤酵母SMD1168和GS115，采用毕赤酵母电转化程序，然后分别筛选出高效表达转化子；

(6)酵母转化子的摇瓶发酵培养：从平板上取少量菌接种于BMGY培养基中培养2天，再转入BMMY培养基中诱导培养两天，离心去除细胞得到含木聚糖酶的上清液，然后对发酵液进行酶活和酶学性质检测；

2)采用上述构建的工程菌发酵培养生产木聚糖酶：在不同规模发酵罐中扩大培养生产木聚糖酶，培养基为每升含磷酸30ml，硫酸钙1g，硫酸钾18g，硫酸镁15g，氢氧化钾4g，甘油40g，0.0004g生物素；发酵工艺为温度30℃，pH5.0，通风量为0.5vvm，搅拌100～500转/分，使溶氧控制在20％以上；发酵分为两个阶段，第一阶段为菌体生长阶段，按5％接入种子后，种子开始在上述培养基中生长，培养时间48小时，当甘油耗尽时，溶氧会迅速上升；此时转入第二阶段，流加诱导培养基，使溶氧始终维持在20％以上，培养时间为100至200小时，微滤去除酵母细胞得到含木聚糖酶的上清液。

2、根据权利要求所述的基因重组毕赤酵母生产耐高温木聚糖酶的方法，其特征在于所述黑曲霉基因通过基因定点技术和DNA全合成技术进行优化，优化后的基因必须编码下列氨基酸序列：

MKVTAAFAGLLVTAFAAPVPEPVLVSRSAGINYVQNYNGNLGDFTYDESAGTFSMYWEDGVSSDFVVGLGWTTGSSNAIT

YSAEYSASGSSSYLAVYGWVNYPQAEYYIVEDYGDYNPCSSATSLGTVYSDGSTYQVCTDTRTNEPSITGTSTFTQYFSV

RESTRTSGTVTVANHFNFWAQHGFGNSDFNYQVMAVEAWSGAGSASVTISS。