[发明专利]固定化酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，特别是在非水相体系中用固定化微生物脂肪酶催化反应合成EGCG脂肪酸酯的方法，属于酶催化领域。

背景技术

绿茶中的茶多酚因具有极强的自由基清除能力和抗氧化活性，在食品、化妆品等工业中得到了广泛的应用，是一种不可多得的天然抗氧化剂。同时，茶多酚具有防癌抗癌、抗衰老、抗辐射、降血糖、血脂等重要的生理药理功能。茶多酚及其衍生物的开发利用在国内外引起了极大关注，多篇文献和发明专利公开了其作为抗氧化剂、抗癌、抗病毒药物的应用。茶多酚中大部分为儿茶素，其中以表没食子儿茶素-3-6-没食子酸酯(EGCG)的含量为最高。然而，茶多酚较差的脂溶性使其应用的范围受到限制。通过改性的方式改变其溶解性、增强稳定性可以有效提高其应用面。改性方式可归类为溶剂法、乳化法和分子修饰法。大量的研究和应用实践表明溶剂法和乳化法存在很多的缺陷，如溶剂挥发、溶剂安全、稳定性差的等。最直接有效的办法是分子修饰法，就是在这些化合物中增加如脂肪酸或甘油酯等的亲油部分，这样可以显著调节这些水溶性天然化合物的脂相溶解度，而且其产品也可以直接水解做进一步代谢，其生物生理活性不受影响，而且可以引入有效的营养成分(如多不饱和脂肪酸)。

国内外已经有化学法改性茶多酚儿茶素的研究。如《精细化工》，19(2)，2002，通过茶多酚与脂肪酰氯反应，制备了一系列含不同直链脂肪基团的脂溶性茶多酚。表明当脂肪链的碳原于数＞10时，脂溶性茶多酚在色拉油中的溶解度是茶多酚的2000倍以上。专利CN1197786A和CN1263083A报道的将水溶性茶多酚改性成脂溶性茶多酚，但由于反应过程中的强酸性环境，无法控制诸如“红粉”的缩合物生成，因而影响产品的抗氧化效果。专利CN1448395A报道采用碳酸氢钠、碳酸氢钾以及金属催化剂，降低反应温度等方式解决以上的问题。但化学合成普遍采用高温、强氧化剂、强活性化学催化剂和化学试剂，例如以上的方法使用的脂肪酸酰氯性质不稳定，制备条件严苛复杂。特别是对产品的质量不利，得率低，产物的结构复杂，反应的选择性不高，产物单体分离困难，生物生理活性可能丧失，甚至有毒害产品形成。

近20年来，非水相酶促合成有了长足的发展，酶不仅可以应用于水解，在非水相中也可以用于合成。酶法合成比化学法的专一性强，产物定向。而且酶的价格也随着生物技术的迅速发展而显著下降，使工业应用不仅从量产而且从经济方面都成为可能。

脂肪酶，是一类特殊的酰基水解酶，能在油-水界面上催化酯水解或醇解、酯合成、酯交换、内酯合成、多肽合成、高聚物合成及立体异构拆分等有机合成反应。根据脂肪酶的催化机理：第一步中，脂肪酶和酰基底物形成一个中间复合物；第二步，亲核试剂(醇、水、胺类等)进攻中间复合物的酰基碳，形成产物，同时作为催化剂的酶重新释放出来。

脂肪酶催化酯合成的研究多集中在直链醇和直链酸之间的反应，反应较易发生。而对于本专利的目标物EGCG来说，由于其独特的酚羟基结构和三个苯环结构的存在，在攻击中间复合物的过程中，很难形成酰基碳。酰基底物的选择是一个难点，要保证中间复合物有较强的反应活性。

另外EGCG具有极强的水溶性，在与脂溶性较强的油脂反应时，溶剂的选择也是一个难以平衡的矛盾。脂肪酶非水相催化选择的溶剂常用依据，即常选择的弱极性类溶剂不适合这一特定目标的反应。不同极性溶剂的选择影响着底物的传质。

酶的存在形式也影响着反应的发生和催化特性。由于游离酶对环境十分敏感，目前酶催化反应常使用固定化形式酶。但不同形式的固定化商业脂肪酶不仅影响着酶活力和底物的传质，最终影响着反应的发生和转化率的高低。

天然酚型或酸型生物活性化合物的酶促合成报道不多，对EGCG的酶促改性还未见文献报道。

发明内容

本发明克服了化学催化剂合成EGCG酯方法的缺点，提供了一种在非水相体系中用固定化微生物脂肪酶催化反应合成EGCG脂肪酸酯的方法。

本发明采用反应活性较高的脂肪酸乙烯酯作为酰基供体，解决了脂肪酶催化EGCG酚羟基反应困难的问题。本发明选择极性较强的溶剂作为反应介质，增大了底物的溶解度，利于反应物之间的传质，加快了反应的历程，且反应溶剂无毒性。本发明采用了新型的固定化脂肪酶，较之于多数的商业化脂肪酶更利于反应的转化，提高了反应转化率。该方法的选择性好，反应温和，产品基本上为单取代产物，产品质量好，分离纯化简单。

本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：