[发明专利]一种分子量内标的制备方法及用该方法制备的分子量内标

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种分子量内标及其制备方法。

发明背景

人类基因组计划开始以来，基因扫描和基因分型技术发展迅速。在致病基因筛查，疾病基因连锁和关联分型，肿瘤等疾病早期诊断、法医学个体识别等方面都广泛应用。基因分型技术重要的手段就是利用DNA测序仪或遗传分析仪分析基因片段的分子量。这类仪器分析分子量时需要一个分子量标准来对样品进行计算，也就是分子量内标，又称为分子量内对照(Internal Lane Standard)。

跟传统的分子量标准(marker)相比，分子量内标属于内对照，而传统的分子量标准属于外对照，内对照与待测样品在同一泳道电泳，二者运动规律完全一致，因此校对结果更加准确。另外，分子量内标的精确度更高，传统分子量标准的电泳介质往往是琼脂糖凝胶和分辨率较低的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)，分辨率在几十个bp左右，而分子量内标的电泳介质是测序的PAGE或毛细管电泳胶，分辨能力可以达到1个bp，因此，这就要求分子量内标的自身分子量非常准确，不能有1个碱基的差别。另外，由于需要将待测样品与分子量标准区分开，分子量内标需要进行荧光标记，才能被仪器识别，并且标记的荧光分子在分析不同标记的样本时需要不同的标记，而传统的分子量标准不带有荧光标记，无法用做内对照。

由于荧光标记的分子量要求分子量精确到1个核苷酸，还需要带有荧光标记，其制作方法也和传统分子量标准差别很大。常规的制备分子量标准方法难以得到大量、准确的荧光标记分子量内标。

发明内容

本发明针对上述领域中的不足，提供一种经济快捷制备分子量内标的方法，同时还提供了由该方法制得的一种全新的分子量内标产品。

一种分子量内标的制备方法，以pUC18质粒为模板，固定上游引物5′GCGAAACCCGACAGGACTA3′，选取相应距离设计下游引物，扩增得到多个核苷酸片段。

所述下游引物分别为

70R：5′ACAGGAGAGCGCACGAGG 3′：

80R：5′CAGGGTCGGAACAGGAGAG 3′；

100R：5′GACAGGTATCCGGTAAGCGG 3′；

120R：5′TTCCCGAAGGGAGAAAGGC 3′；

140R：5′GCTATGAGAAAGCGCCACG 3′；

160R：5′CTGAGATACCTACAGCGTGAGC 3′；

180R：5′AGCGAACGACCTACACCGA 3′；

200R：5′GTGCACACAGCCCAGCTTG 3′；

240R：5′TACCGGATAAGGCGCAGC 3′；

280R：5′GATAAGTCGTGTCTTACCGGGT 3′；

320R：5′CGCTCTGCTAATCCTGTTACCA 3′；

360R：5′GCCACCACTTCAAGAACTCTGT 3′；

400R：5′CAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGT 3′；

450R：5′ATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCC 3′；

490R：5′ACAAAAAAACCACCGCTACCA 3′；

500R：5′CTGCTTGCAAACAAAAAAACC 3′；

分别扩增得到70bp，80bp，100bp，120bp，140bp，160bp，180bp，200bp，240bp，280bp，320bp，360bp，400bp，450bp，490bp，500bp片段。

所述扩增反应条件为：94℃2min；30cycles：94℃20sec，58℃40sec，72℃40sec；70℃10min。

所述上游引物带有荧光标记物。

所述荧光标记物为ROX，FAM，HEX，JOE，TMR，TET，VIC，LIZ或Cy5。

上述方法制备得到的分子量内标。