[发明专利]悬浮培养原生植株药用有效成份的铁皮石斛胚状体工艺

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种高等植物生物技术克隆工程，特别是针对像铁皮石斛这种在自然环境中生长十分缓慢，对环境条件要求十分苛刻，生物量十分低下，目前自然资源十分枯竭、濒灭而名贵的中药材。

技术背景：

“21世纪是生物技术的世纪”。随着城市化进程的迅速发展和人口的不断增长，生态环境的不断退化，使许多名贵中药材资源枯竭和濒灭。尤其像铁皮石斛这类，生长缓慢、对环境要求十分苛刻、生物量又及其低下的物种更是“首当其冲”。虽然从上个世纪80年代开始，人们试图用种子繁殖，人工栽培等手段或通过组织培养，诱导种子原茎球来扩增植株，再进行人工引种栽培等方法，扩大铁皮石斛的生产。但是迄今成效甚微。

本发明根据高等植物细胞的两个全能性：植物细胞具有分化成完整植株的全能性和植物细胞能合成原生植株药用有效成份的全能性。根据这样的理论基础，针对铁皮石斛这一具体物种，发明了一整套从铁皮石斛原生植株成株茎段休眠芽上直接诱导出胚状体，从源头上保证了药材的“原汁原味”。

本发明有别于通常的组织培养中使用的脱分化和再分化手段筛选后代的做法。一般地说，凡通过脱分化过程容易引起遗传变异，较难保证药材的“地道”标准。利用本发明的铁皮石斛胚状体悬浮培养技术工艺，其生长速率达到8.4～9.2毫克/克·天；相当于自然生长速度的1300倍以上。“固液比”达到25～35％，每10天收获一次得干率10％以上。经胚状体细胞核DNA与原生植株细胞核DNA对比检测，两者的DNA完全相同。其遗传稳定性可靠。通过实施本发明的技术工艺，使铁皮石斛的生物培养规模从实验水平向工厂化生产规模转化提供了物质保证。

发明内容：

本发明公开了直接从铁皮石斛原生植株成株茎段的休眠芽上诱导出胚状体的技术工艺。有别于通过脱分化、细胞再分化成芽簇或植株的过程。铁皮石斛带休眠芽茎段，经常规灭菌后，在超净台上切取带节的切段，插入到1/2 MS.矿物盐类成份2.5％蔗糖和0.5％麦芽糖为炭源、5％香蕉汁、4.5克/升琼脂粉、PH5.8、NAA、BA适量的固体培养基上。29℃±1，自然室内光照条件，经45～50天后，在休眠芽上生长出浅绿色的起始胚状体。等到起始胚状体“球”长到黄豆粒大小时，小心地、及时地将胚状体球剥离外植体，放在相同的上述培养基上扩增。达到足够数量后，转入到上述培养基去掉琼脂粉的液体培养基中，进行悬浮培养，每个150毫升三角瓶装液75毫升，每瓶按5％(W/W)接种率接种；每7天继代一次；经3-4次继代后；进入筛选程序，从培养物中不断挑选出那些生长紧密、呈圆球状、浅绿色、增殖速度快的胚状体“球”，淘汰那些长成丛芽状或芽簇状的培养物。通过3～4个月的连续筛选，最终达到每10天收获一次，其“固液比”达到25～35％，多糖含量达到16％以上；“比生物生长速率”达到8.4～9.2毫克/克·天；并能保持周年稳定的成熟系。

本发明公开了一种通过铁皮石斛原生植株成株茎段上的休眠芽，直接诱导出胚状体，在人工控制条件下，促进它的无限增殖，其遗传稳定性，经DNA检测完全与原植株相同。按本发明的技术工艺可以生产出符合铁皮石斛原生植株药用有效成本的干粉，扩大市场供应量，满足人们的需要。

实施案例：

下面结合实施案例，对本发明作进一步的描述，但不是限制本发明的局限性。

附图说明

附图1，铁皮石斛悬浮培养胚状体生产原生植株药用有效成干粉技术工艺流程图

实施例1.铁皮石斛胚芽的悬浮培养(见附图1)

1.铁皮石斛外植体采集、灭菌：采集野外生长的铁皮石斛植株成年茎段，一般带有7～10节(叶)茎段。先用自来水冲洗干净，用眼科尖头镊子仔细地剥去叶片和叶鞘，用手术刀切成带3～4节切段、50％乙醇、浸润3～5秒钟，放入用无菌水新配的0.1％升汞溶液中，15～17分钟；然后转入到同样用灭菌水新配制的饱和次氯酸钠或饱和次氯酸钙溶液中7～8分钟；在超净台上，用灭菌水冲洗后，浸泡在灭菌水中约20分钟；放到灭菌吸水纸上吸干多余的水份；用灭菌刀片切取带节茎段，节的上下各留0.5公分，然后按生物学上的上下极插入到诱导胚状体的固体培养基上；每个150毫升的三角瓶，装量75毫升，每瓶插一段。