[发明专利]一种治疗习惯性流产的生物学制剂

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用非细胞成分取代传统细胞成分制作治疗不明原因习惯性流产的免疫学制剂，属医药技术领域。

背景技术

习惯性流产是指连续发生三次或以上流产者，发病率约占总妊娠数的1％，占自然流产数的15％，为一种严重危害孕妇身心健康的产科疾病。临床曾有病例连续发生7次流产者，病人十分痛苦。此种疾病病因十分复杂，包括遗传因素、解剖异常、内分泌异常、感染等等，但是，在排除上述临床病因后，仍有59.42％的习惯性流产患者，称为不明原因习惯性流产URSA(Unexplanted recurrent spontaneous abortion)，它与母体免疫因素有关，已成为目前人们关注的热点。目前临床上将URSA患者分为自身免疫型和同种免疫型两大类，其中国内外针对同种免疫型URSA患者，常规采用“免疫细胞过继疗法”进行治疗，旨在诱导受孕母体对半同种异体胎儿抗原的免疫耐受，帮助孕妇度过危险期。

虽然此方法的疗效较肯定，国内外报道有效率达70％-95％，但仍存在以下不足，从而限制了它的临床应用：(1)治疗用免疫细胞的制备难度较大；(2)个体之间差异较大，影响疗效的稳定性；(3)免疫细胞的新鲜分离稳定性差，因此，使用免疫细胞的技术方案仍然不是人们理想的方案。

有资料表明，采用丈夫或无关男性个体淋巴细胞过继治疗的疗效无统计学差异，且发挥免疫耐受诱导作用的是T细胞。这说明，采用男性同种异体T细胞进行过继转输均可能通过不同男性个体T细胞上的某些共同抗原成分发挥作用，诱导母体对半同种异体胎儿抗原的免疫耐受；而T细胞在生长增殖过程中分泌释放的一种称为exosomes的非细胞成分膜性微囊结构，浓缩了整套T细胞自身的抗原成分，并可克服细胞成分治疗的诸多缺点，有可能开辟一条新的治疗免疫性疾病的道路。目前采用exosome进行临床应用的实验室探索，多局限于做为生物治疗载体应用于肿瘤治疗，以促进机体的抗瘤免疫效应为目的。但有关其做为免疫耐受诱导剂用于习惯性流产的治疗，则尚未见文献报道，更不用说进入实用治疗的制剂了。

发明内容

本发明所用于克服已有技术的不足、从而提供一种便于临床规范使用的治疗习惯性流产的生物学制剂。

本发明的问题是以下述技术方案实现的：

一种治疗习惯性流产的生物学制剂，它以男性外周血为原材料，并按下述步骤进行：

a.培养男性外周血T细胞：

抽取健康成年男性外周血50ml；玻璃球脱纤维Hanks液1.5倍稀释，分离淋巴细胞，收集单个核细胞；Hanks液清洗，用RPMI-1640完全培养液重悬、计数，并调整细胞浓度至2×10⁶/ml，加入植物血凝素(PHA)，使终浓度为100μg/ml；37℃培养72h；收集培养液的上清，4℃保存备用；

b.制备T细胞exosomes：

取上述外周血T细胞培养上清，以1500g离心10min去除细胞及细胞碎片；分子量100000超滤管过滤浓缩5倍后；以30mg/ml蔗糖/D₂O为密度垫，以100000g超速低温离心75min，收集底部的缓冲垫；PBS稀释，100000g超速低温离心75min，获得exosomes；0.22μm无菌滤膜过滤分装，-80℃保存备用。

上述治疗习惯性流产的生物学制剂，所述体外培养应换用新鲜含PHA的培养液、在体外反复刺激、培养，均至镜下观察转化率大于75％。

一种治疗习惯性流产的生物学制剂的用途，可用于制备治疗习惯性流产、自身免疫性疾病的药剂或器官移植后免疫耐受的诱导剂。

本发明提供了一种非细胞免疫生物学制剂，它能有效地诱导机体的免疫耐受，克服了免疫细胞过继疗法诱导免疫耐受的诸多不足，使临床应用更为简单易行；本制剂可以按照GMP标准进行大规模工业化制备，使质量控制更为稳定、可控性更强。将其应用于治疗习惯性流产，取得良好的疗效。本发明提供的生物学制剂，其机理也可用于其他自身免疫性疾病、器官移植后免疫耐受的诱导，等等。

具体实施方式

本发明分为两大步骤，一是健康成年男性外周血T细胞的体外刺激和培养，二是以离心超滤及蔗糖密度梯度离心法制备T细胞exosomes。