[发明专利]一种检测大豆脂肪氧化酶同功酶的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测大豆脂肪氧化酶同功酶的方法和专用试剂盒，属于生物技术检测方法技术领域。

背景技术

大豆中含有三种脂肪氧化酶(Lipoxygenase，简称Lox)同功酶即Lox1、Lox2和Lox3，它们能专一催化具有cis，cis-1，4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸通过分子加氧，形成具有共轭双键的氢过氧化衍生物，即醛、酮等具有挥发性的异味物质，使大豆具有豆腥味，从而降低了豆制品的耐储性、食用性和营养价值。通常在大豆加工过程中人们通过加热、微波照射、改变介质的pH值、有机溶剂萃取和醛水解酶等方法消除豆腥味，但这些方法都会不同程度地降低豆制品的营养价值，并且使得成本增高，培育脂肪氧化酶缺失品种可以从根本上解决上述问题。但在脂肪氧化酶缺失材料的选育过程中，Lox在田间不存在指示性状，从种子外观和农艺性状上无法鉴别，并且田间脂肪氧化酶缺失材料选择工作量大，因此急需一种快速、简便、成本低、一次可以同时检测出三种脂肪氧化酶的检测方法。

目前脂肪氧化酶的常用的检测方法是薄层等电聚焦电泳(IEF)检测方法，这种方法主要是通过酶染法和蛋白染色方法结合使Lox同功酶带显色，虽然能同时检测出三种脂肪氧化酶，但检测中常常会因Lox的缺失而发生其它Lox等电点正极漂移现象；另外该方法所需设备、试剂昂贵，操作要求严格，一般育种、仓储单位和加工质检部门不便操作。

另外据日本Suzuki，Y.等1992年报道(Prodution and use ofmonolional antibodies against rice embryo lipoxygenase-3.BiosciBiotech.Biochem.56：678-679)：用单克隆抗体可以检测水稻中的Lox3，这种方法虽然结果准确可靠，但检测过程中除需要做封闭外，还需要过夜包被酶标板，因此耗时，操作起来不方便。

申请号00112539.7的专利公开了一种作物脂肪氧化酶同功酶的检测方法，该方法具有操作简便、结果直观等特点。但由于它是利用脂肪氧化酶的偶联氧化还原指示剂显色反应的原理来进行测定的，所以它的灵敏度和特异性受到一定的限制。

发明内容

本发明的目的在于避免上述方法的缺陷，而提供一种利用双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)检测大豆中三种脂肪氧化酶同功酶的方法和专用试剂盒。适用于对大豆中三种脂肪氧化酶的定性和定量测定。

本发明是这样实现的：这种检测大豆脂肪氧化酶同功酶的方法，其特征在于包括如下步骤：

A、制备大豆Lox1、Lox2和Lox3的单克隆抗体试剂(D-1、D-2、D-3)：诱发哺乳动物产生特异抗体，制备特异杂交瘤细胞，通过筛选阳性细胞株，诱导小鼠产生腹水得到大豆Lox1、Lox2和Lox3的单克隆抗体试剂(D-1、D-2、D-3)；

B、制备多克隆抗体：利用Sigma公司的Soybean Lox type1-B产品(I)作为免疫抗原诱发哺乳动物产生多克隆抗体血清，得到多克隆抗体；

C、制备阳性和阴性对照试剂(B-1、B-2)：以含有3种Lox的普通大豆种子中提取的总蛋白制备阳性对照试剂(B-1)；以脂肪氧化酶全缺失大豆种子中提取的总蛋白制备阴性对照试剂(B-2)；

D、包被酶标板：将步骤B得到的多克隆抗体结合到酶标板上，制备检测时所用酶标板(K)；

E、检测：将步骤A和C制备的试剂、步骤D包被的酶标板以及检测过程应用的辅助试剂装在试剂盒内，检测时在酶标板(K)中加上样品后，再加入单克隆抗体试剂(D-1、D-2、D-3)，同时做阳性和阴性对照，利用抗原抗体的结合反应，通过显色检测酶的存在和酶的含量。

所述检测大豆脂肪氧化酶同功酶的方法，步骤A所述哺乳动物选择小白鼠，制备大豆Lox1、Lox3的特异单克隆抗体试剂(D-1、D-3)的步骤如下：

①Lox1和Lox3的分离纯化：以美国的脂肪氧化酶缺失近等基因系材料Century中的Lox-1.3和Lox-2.3作为标准对照，首先采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳从“冀豆12号”中分离得到3条Lox酶带；然后将Lox1和Lox3酶带切下，置于电洗脱仪洗脱管中，采用电洗脱法洗脱5～6小时，分别得到Lox1和Lox3的纯化溶液；