[发明专利]一种检测大豆脂肪氧化酶同功酶的方法及试剂盒

权利要求书

1、一种检测大豆脂肪氧化酶同功酶的方法，其特征在于包括如下步骤：

A、制备大豆Lox1、Lox2和Lox3的单克隆抗体试剂(D-1、D-2、D-3)：诱发哺乳动物产生特异抗体，制备特异杂交瘤细胞，通过筛选阳性细胞株，诱导小鼠产生腹水得到大豆Lox1、Lox2和Lox3的单克隆抗体试剂(D-1、D-2、D-3)；

B、制备多克隆抗体：利用Sigma公司的Soybean Lox type1-B产品(I)作为免疫抗原诱发哺乳动物产生多克隆抗体血清，得到多克隆抗体；

C、制备阳性和阴性对照试剂(B-1、B-2)：以含有3种Lox的普通大豆种子中提取的总蛋白制备阳性对照试剂(B-1)；以脂肪氧化酶全缺失大豆种子中提取的总蛋白制备阴性对照试剂(B-2)；

D、包被酶标板：将步骤B得到的多克隆抗体结合到酶标板上，制备检测时所用酶标板(K)；

E、检测：将步骤A和C制备的试剂、步骤D包被的酶标板以及检测过程应用的辅助试剂装在试剂盒内，检测时在酶标板(K)中加上样品后，再加入单克隆抗体试剂(D-1、D-2、D-3)，同时做阳性和阴性对照，利用抗原抗体的结合反应，通过显色检测酶的存在和酶的含量。

2、根据权利要求1所述检测大豆脂肪氧化酶同功酶的方法，其特征在于：步骤A所述哺乳动物选择小白鼠，制备特异大豆Lox1、Lox3的单克隆抗体试剂(D-1、D-3)的步骤如下：

①Lox1和Lox3的分离纯化：以美国的脂肪氧化酶缺失近等基因系材料Century中的Lox-1.3和Lox-2.3作为标准对照，首先采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳从“冀豆12号”中分离得到3条Lox酶带；然后将Lox1和Lox3酶带切下，置于电洗脱仪洗脱管中，采用电洗脱法洗脱5～6小时，分别得到Lox1和Lox3的纯化溶液；

②小鼠首次免疫：选择4～6周龄行动敏捷的纯系BALB/c雌小鼠，取步骤①中制备的Lox1和Lox3纯化液分别作为抗原与等体积的完全付氏佐剂混合并振荡，形成油包水状态后，分别吸入到一支注射器当中给不同的小鼠进行皮下多点注射，每只小鼠只注射一种抗原，每只注射的免疫剂量为25～35ug；

③再次免疫：间隔1周后利用步骤①制备的Lox1和Lox3的纯化液分别与不完全付氏佐剂等体积混合按照步骤②再次进行免疫，如此进行第三次免疫；

④效价测定及再免疫：步骤③中的小鼠第三次免疫后第四天从小鼠尾部分别取血2-3滴，离心取上清，用间接酶联免疫吸附法测定其效价，如果效价小于1∶1600，则对步骤③中免疫的小鼠1周后按照步骤③再次进行免疫，并进行效价测定，直至血清效价达到或高于1∶1600为止；

⑤加强免疫：分别选择步骤④中Lox1和Lox3免疫小鼠血清效价最高的小鼠在细胞融合前3天按步骤③加强免疫1次；

⑥细胞融合：分别取步骤⑤中的不同小鼠的脾细胞与复苏的SP2/0细胞混匀，在细胞培养板HAT培养基上分别筛选Lox1和Lox3杂交瘤细胞；

⑦特异性阳性细胞株筛选：细胞融合7～15天后，利用步骤①中分离纯化的Lox1和Lox3分别作为检测抗原，采用间接酶联免疫吸附法对步骤⑥中长有相对应杂交瘤细胞孔内的上清液进行首次阳性细胞株筛选，上清液的OD450值与空白对照孔的OD450值之比大于2.1的即判断为阳性孔，其中的杂交瘤细胞称为阳性细胞株；

⑧亚克隆：采用有限稀释法对步骤⑦中筛选到的Lox1和Lox3阳性细胞株分别进行亚克隆，连续两次亚克隆之后剔除掉假阳性细胞株，将得到的Lox1和Lox3阳性细胞株通过分别与脂氧酶全缺失大豆品种中其它蛋白交叉反应，证明这些细胞株分别为特异性分泌Lox1和Lox3单克隆抗体的细胞株；

⑨单克隆抗体腹水制备：将步骤⑧中得到的分泌Lox1和Lox3单克隆抗体细胞株分别以(1～2)×10⁶个细胞/只的量接种到经过石蜡油预处理过的不同BALB/C小鼠腹腔，诱导腹水产生，经过6～8天后即可采集腹水，分别得到Lox1和Lox3单克隆抗体试剂(D-1、D-3)。