[发明专利]一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种全基因组的改造方法，特别是涉及一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法。

背景技术

酿酒酵母乙醇发酵的糖-醇转化率、发酵速率以及对乙醇的耐受力是受多基因调控的复杂遗传性状，很难通过传统的诱变育种、代谢工程以及针对特定基因或代谢途径的其它遗传操作方法进行改善。因此采用全基因组系统工程的方法对酿酒酵母进行遗传改造无疑是解决上述问题的更有效途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种构建酿酵母乙醇高产菌株的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法，包括如下步骤：

(1)以Ycplac33为载体，构建带有受半乳糖诱导启动子调控的HO基因的质粒YCplac33-GHK；该质粒载有HO基因的开放阅读框和终止子，HO基因的启动子是诱导型启动子GAL2，同时该质粒还载有KanMX选择标记；

(2)将质粒YCplac33-GHK转入酿酒酵母双倍体菌株MATa/α中，通过半乳糖诱导后再做PCR验证菌株的交配型即可得到同宗配合的酵母双倍体细胞MATa/a和MATα/α，将它们进行融合后通过PCR验证菌株的交配型，其中PCR产物有544bp和404bp两条带对于的菌株即酿酒酵母四倍体；

(3)用芬苯达唑(methyl benzimidazole-2-yl-carba-mate，MBC)处理所述酿酒酵母四倍体，使之发生染色体缺失，通过乙醇发酵得到非整倍体酿酒酵母乙醇高产菌株。

优选的是：所述步骤(1)为：

1)提取酵母染色体DNA，并以其为模板，用引物GAL2-up和GAL2-dn，做PCR扩增，得到786 bp的PCR产物，此DNA片段是GAL2基因启动子序列；所述引物GAL2-up为5′-GGGCCCGAATTCATGCTTTCTGAAAACACGAC-3′，所述引物GAL2-dn为5′-GGGCCCGAGCTCGTTAAGACTGCATTCATCAC-3′；

2)用体积比为1∶1的苯酚-氯仿混合物纯化PCR产物；分别用EcoRI和SacI双酶切纯化后的PCR产物和质粒YCplac33；然后做连接并将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中，待含有IPTG和X-Gal的LBA平板上长出转化子后提质粒；再用EcoRI和SacI双酶切，将酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳进行验证，即得到质粒YCplac33-G；

3)以HO质粒为模板，用引物HO-up和HO-dn做PCR扩增，得到2154bp的PCR产物，此DNA片段是HO基因的ORF和终止子序列；分别用SacI和SmaI双酶切纯化后的PCR产物和质粒YCplac33-G；然后做连接并将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中，待LBA平板上长出转化子后提质粒；再用SacI和SmaI双酶切，将酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳进行验证，即得到质粒YCplac33-GH；所述引物HO-up为5′-GGGCCCGAGCTCCGCCAGATCTGTTTAGCTTG-3′；所述引物HO-dn为5′-GGGCCCCCCGGGAGTATCGAATCGACAGCAGT-3′；

4)以质粒pFA6a-KanMX4为模板，用引物KAN-up和KAN-dn做PCR扩增，得到1446bp的PCR产物，此DNA片段是KanMX因的启动子、ORF和终止子序列；分别用XbaI和SphI双酶切纯化后的PCR产物和质粒YCplac33-GH；然后做连接并将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中，待LBA平板上长出转化子后提质粒；再用XbaI和SphI双酶切，将酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳进行验证，即得到质粒YCplac33-GHK，所述引物KAN-up为5′-GGGCCCTCTAGAGCGAAGGCACATCTATTAC-3′，所述引物KAN-dn为5′-GGGCCCGCATGCGTTCTCCTCAACTGCCATTA-3′。

所述步骤(2)为：