[发明专利]一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法

权利要求书

1.一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法，其特征是包括如下步骤：

(1)以Ycplac33为载体，构建带有受半乳糖诱导启动子调控的HO基因的质粒YCplac33-GHK；该质粒载有HO基因的开放阅读框ORF和终止子，HO基因的启动子是诱导型启动子GAL2，同时该质粒还载有KanMX选择标记；

(2)将质粒YCplac33-GHK转入酿酒酵母双倍体菌株MATa/α中，通过半乳糖诱导后再做PCR验证菌株的交配型即可得到同宗配合的酵母双倍体细胞MATa/a和MATα/α，将它们进行融合后通过PCR验证菌株的交配型，其中PCR产物有544bp和404bp两条带对应的菌株即酿酒酵母四倍体；

(3)用芬苯达唑处理酿酒酵母四倍体，使之发生染色体缺失，通过乙醇发酵从而得到非整倍体酿酒酵母乙醇高产菌株。

2.根据权利要求1所述的一种构建酿酒酵母乙醇高产菌株的方法，其特征是所述步骤(1)为：

1)提取酵母染色体DNA，并以其为模板，用引物GAL2-up和GAL2-dn做PCR扩增，得到786 bp的PCR产物，此DNA片段是GAL2基因启动子序列；所述引物GAL2-up为5′-GGGCCCGAATTCATGCTTTCTGAAAACACGAC-3′，所述引物GAL2-dn为5′-GGGCCCGAGCTCGTTAAGACTGCATTCATCAC-3′；

2)用体积比为1∶1的苯酚-氯仿混合物纯化PCR产物；分别用EcoRI和SacI双酶切纯化后的PCR产物和质粒YCplac33；然后做连接并将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中，待含有IPTG和X-Gal的LBA平板上长出转化子后提质粒；再用EcoRI和SacI双酶切，将酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳进行验证，即得到质粒YCplac33-G；

3)以HO质粒为模板，用引物HO-up和HO-dn做PCR扩增，得到2154bp的PCR产物，此DNA片段是HO基因的ORF和终止子序列；分别用SacI和SmaI双酶切纯化后的PCR产物和质粒YCplac33-G；然后做连接并将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中，待LBA平板上长出转化子后提质粒；再用SacI和SmaI双酶切，将酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳进行验证，即得到质粒YCplac33-GH；所述引物HO-up为5′-GGGCCCGAGCTCCGCCAGATCTGTTTAGCTTG-3′；所述引物HO-dn为5′-GGGCCCCCCGGGAGTATCGAATCGACAGCAGT-3′；

4)以质粒pFA6a-KanMX4为模板，用引物KAN-up和KAN-dn做PCR扩增，得到1446 bp的PCR产物，此DNA片段是KanMX基因的启动子、ORF和终止子序列；分别用XbaI和SphI双酶切纯化后的PCR产物和质粒YCplac33-GH；然后做连接并将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中，待LBA平板上长出转化子后提质粒；再用XbaI和SphI双酶切，将酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳进行验证，即得到质粒YCplac33-GHK，所述引物KAN-up为5′-GGGCCCTCTAGAGCGAAGGCACATCTATTAC-3′，所述引物KAN-dn为5′-GGGCCCGCATGCGTTCTCCTCAACTGCCATTA-3′。