[发明专利]鸡γ－干扰素在重组杆状病毒中的表达及抗病毒活性的测定

说明书

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，涉及鸡γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及其抗病毒活性的测定

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是在特定的抗原刺激下由细胞分泌的一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能等生物活性的糖蛋白，是发现最早，研究最多的细胞因子。根据IFN的细胞来源和结合受体不同，将IFN分为I型和II型。I型IFN主要有α、β两个亚型，分别主要由淋巴细胞和成纤维细胞产生^[1]，它们作用于同一受体，可抑制病毒DNA复制和蛋白质合成，活化NK细胞，促进MHC I类分子提呈抗原。II型IFN为γ-干扰素，主要由T细胞和NK细胞产生^[2]，与I型IFN相比有多种免疫学活性，具有促进MHC II类抗原表达、增强APC细胞与T细胞的相互作用、增强辅助T细胞和细胞毒性T细胞的产生等诸多免疫调节活性，既可以单独作为生物制剂应用于疾病的防治，也可作为免疫佐剂增强疫苗的免疫效果^[3～4]。鸡γ-干扰素(Chicken interferon-γ，ChIFN-γ)全基因为495个碱基，编码164个氨基酸，前19个氨基酸为信号肽，后145个氨基酸为成熟多肽，含有两个糖基化位点^[5]，成熟的蛋白质为2条145个氨基酸的多肽链组成的同源二聚体^[6～7]，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多方面的生物学活性^[8]。

1995年Digby等首先克隆出ChIFN-γ基因，此后国内外学者利用基因工程技术生产重组ChIFN-γ的研究随之开始兴起。迄今为止，ChIFN-γ基因已在大肠杆菌^[9]、猴肾细胞、成纤维细胞^[10]等细胞中获得表达。与原核表达系统相比，杆状病毒表达系统可以对外源蛋白进行多种翻译后加工和修饰，表达重组蛋白更接近天然结构。为此，本研究采用BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统(BAC-TO-BAC Baculovirus Expression System)对ChIFN-γ全基因进行了表达，构建含有ChIFN-γ完整开放阅读框的重组杆状病毒，感染sf9细胞表达出具有高效抗病毒活性的rChIFN-γ。我国是养鸡大国，每年因病毒性疾病的爆发给养鸡业带来巨大损失，研制出具有高效抗病毒活性和免疫调节活性的基因工程rChIFN-γ无疑在鸡病防治上具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的：采用BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统(BAC-TO-BACBaculovirus Expression System)对ChIFN-γ全基因进行了高表达，构建含有ChIFN-γ完整开放阅读框的重组杆状病毒，感染昆虫细胞表达出具有高效抗病毒活性的重组ChIFN-γ。

为了达到本发明的目的，采用BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统(BAC-TO-BAC Baculovirus Expression System，由美国Gibco brl公司开发)对IFN-γ全基因进行了表达：构建含有IFN-γ完整开放阅读框的重组杆状病毒，感染昆虫细胞表达IFN-γ，通过间接IFA和间接ELISA方法，证实目的蛋白在昆虫细胞中获得表达。并采用VSV*GFP-CEF细胞系统通过感染复制抑制试验测定重组鸡IFN-γ抗病毒活性，达到2×10⁵IU/ml。

发明效果：

(1)目的蛋白表达的高效性：选用昆虫细胞优势密码子对GENEBANK中提交的鸡IFN-γ基因序列进行密码子优化，以便目的蛋白在杆状病毒-昆虫细胞中高效表达；

(2)目的蛋白获得的时效性：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中重组病毒的筛选是在大肠杆菌中进行，利用抗性基因和PCR筛选，并采用杆状病毒穿梭载体技术，如此大大缩短了病毒纯化和鉴定的时间，使原来的几个月时间缩短到几周，大大缩短了实验时间；

(3)杆状病毒表达系统是目前颇受欢迎的一种表达系统，它可以进行多种翻译后修饰作用，包括糖基化、脂肪酸酰化、氨基末端乙酰化、羧基末端酰胺化和信号肽的切割、转运，所表达蛋白在结构和功能上与天然蛋白比较接近。重组杆状病毒感染昆虫细胞表达的重组IFN-γ进行了多种翻译后加工和修饰作用，产物和天然IFN-γ一样可以进行分泌型表达，具有较高的生物学活性。

(4)生物安全性：杆状病毒具有高度的种属特异性，仅感染昆虫，对脊椎动物无感染性，其表达产物安全可靠。