[发明专利]鸡γ－干扰素在重组杆状病毒中的表达及抗病毒活性的测定

权利要求书

1.鸡γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达，其特征在于将GeneBank中提交的鸡γ-干扰素基因序列进行密码子优化并人工合成得到pMD-18T-ChIFN-γ，EcoR I和Sal I双酶切pMD-18T-ChIFN-γ，将编码ChIFN-γ基因DNA克隆至pFastBac^TM1，构成pFastBac^TM1-ChIFN-γ；将pFastBac^TM1-ChIFN-γ转化DH_10Bac，提取质粒，PCR筛选阳性重组杆状病毒基因组克隆rBacmid-ChIFN-γ，制备阳性重组基因组克隆DNA，采用Cellfectin^RReagent(Invitrogen)转染sf9细胞，待细胞出现病变后，按文献^[12]介绍的方法进行重组病毒嗜斑纯化和病毒扩增，蛋白酶K-SDS-酚/氯仿抽提病毒基因组DNA，M13-48f(5’GTTTTCCCAGTCACGAC3’)和M13-47r(5’CAGGAAACAGCTATGAC3’)为引物PCR验证ChIFN-γ基因在纯化病毒中获得稳定重组，重组病毒命名为rBac-ChIFN-γ；

上述rBac-ChIFN-γ种毒液按1∶10体积比感染新鲜制备sf9细胞，至细胞病变达90％时，收获细胞用PBS洗涤重悬后滴于载玻片上，自然阴干后95％乙醇固定，同时设野生型杆状病毒感染细胞为阴性对照。分别以1∶100稀释鼠抗原核表达重组ChIFN-γ免疫血清和相同倍数稀释的非免疫小鼠血清为一抗；PBST(0.05％Tween20)洗涤后加入1∶50倍稀释荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG为二抗，作用30min，PBST洗涤后荧光显微镜观察结果。

2.根据权利要求1所述的鸡γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达，其特征在于其抗病毒活性的测定采用VSV*GFP-CEF细胞系统测定重组ChIFN-γ抗病毒活性，以2×10⁴cells/孔密度将CEF铺于24孔板，待细胞贴壁后，加入2×10～2×10⁶不同稀释倍数的重组ChIFN-γ(rBac-ChIFN-γ感染sf9细胞的培养上清)，37℃作用过夜。100pfu/孔VSV*GFP感染细胞，1小时后换完全培养液，24小时后荧光显微镜观察结果，以荧光亮度为对照孔50％的最高稀释度为一个单位(IU)。