[发明专利]球虫重组卡介苗及制备方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种球虫重组卡介苗，包括穿梭表达载体球虫重组卡介苗和整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗，同时还公开了其制备方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

鸡球虫病是由艾美尔属的一种单细胞寄生性原虫引起的严重危害养禽业发展的重要疾病之一，遍及世界各地。长期以来本病防治主要依赖于药物，但由于鸡球虫的抗药性日趋严重，加之普遍存在的药物残留、研制开发新药成本高、周期长，免疫效果差，免疫程序复杂等问题，使人们将目光转向了分子疫苗。加强免疫效果以及对免疫增强剂的研究已成为当前球虫疫苗研究的热点。人们曾尝试过将球虫的抗原基因在不同的表达环境进行表达，但目前仍没有一种抗原基因能够提供完全的免疫保护，而且受表达系统的限制，以大肠杆菌为原核表达系统的重组蛋白抗原性较差。因此，有必要采用基因工程方法发展一种高效，廉价的新型鸡球虫疫苗。

卡介苗是目前世界上应用最广泛、最安全的疫苗。它本身是一种很好的非特异免疫增强剂，能增加机体免疫功能，单次接种即能诱导机体产生完全持久的细胞免疫和体液免疫，并且易于生产，价格低廉，适宜于广大农村。这些优势使卡介苗成为表达重组外源基因的一种非常理想的活菌疫苗载体。

发明内容

本发明的目的是提供一种球虫重组卡介苗，包括两种抗柔嫩艾美耳球虫的新型疫苗，即穿梭表达载体球虫重组卡介苗和整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗。

本发明的技术解决方案如下：

首先获得柔嫩艾美耳球虫保护性抗原基因，进行TA克隆，测序鉴定正确后酶切回收目的片段，再分别与同样进行酶切反应的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体PMV261和整合表达载体PMV361相连，重组质粒转化到BCG，经抗性和PCR筛选得到阳性柔嫩艾美耳球虫重组卡介苗，包括穿梭表达载体球虫重组卡介苗和整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗。

本发明所提供的两种重组卡介苗疫苗菌株，将其命名为rBCG PMV261-RHO和rBCG PMV361-RHO.

本发明以球虫保护性抗原Rhomboid基因为例，进行穿梭表达载体和整合表达载体的构建。

1、穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗的制备：

从构建的柔嫩艾美耳球虫杂交虫株F2cDNA表达文库中筛选出1个Rhomboid蛋白家族相关基因，根据已克隆的柔嫩艾美耳球虫Rhomboid新基因序列的开放阅读框设计引物进行PCR，TA克隆。测序鉴定正确后进行双酶切，切胶回收，与进行同样酶切的pMV261穿梭表达载体进行连接，转入DH5α中，将重组质粒Rho-261电穿孔转化卡介苗中，37℃培养至对数生长期后，筛选BCG重组子，PCR证实为阳性克隆后进行45℃热诱导表达，对基因表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及Western blotting鉴定。

将制备好的穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗rBCG PMV261-RHO以100ug/只的剂量通过滴鼻点眼、口服、颈部皮下注射三种不同免疫途径免疫雏鸡，并同时设BCG组和红、白对照组，三免一周后口服接种柔嫩艾美耳球虫卵囊进行攻虫试验，对保护率、相对增重率、OPG、ACI、体液免疫水平和细胞免疫水平检测等指标进行综合评价。

穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗rBCG PMV261-RHO可对抗中等剂量球虫的攻击，试验组和对照组相比，攻虫后卵囊排出量显著减少，体重增长显著增加，盲肠病变较小，保护率达到78.8％以上。各项指标均明显优于对照组(结果见表1)。其中阴性对照组ACI值为90.6，而rBCG PMV261-RHO免疫组ACI值分别为208.1、181.4、167.2，说明使用重组卡介苗疫苗能不同程度的提高抗球虫指数，而滴鼻点眼和口服组ACI值均达到180以上，以这两种途径免疫抗球虫效果非常有效。BCG免疫的三组其ACI值在154.6~171.0之间，效果也明显高于对照组，提示我们单独使用BCG对增强鸡球虫免疫保护力也有一定的效果，其中以口服方式免疫效果更好。穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗免疫雏鸡后能诱导有效的细胞免疫和体液免疫，表现为CD4+、CD8+T细胞数量和特异性抗体滴度明显高于对照组(P＜0.01)。

2、整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗的制备：