[发明专利]区分犬瘟热病毒疫苗株和野毒株的一段序列和一个酶切位点

说明书

技术领域：

本发明涉及一种区分犬瘟热病毒疫苗株和野毒株的一段序列和一个酶切 位点，是融合反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和限制性内切酶分析(RFLP) 两种常规分子生物学鉴定检测方法的发明，选择特异的核酸片段和一种限制 性内切酶，有效地鉴别犬瘟热病毒的接种疫苗株和感染野毒株。

背景技术：

中和试验、免疫荧光抗体技术、酶联免疫吸附测定等方法已经在犬瘟热 的诊断中发挥了作用。另外，电镜诊断法与上述方法相比较，其检出率有显 著的一致性。虽然上述方法取得了一定的效果，但有的耗时较长，有的敏感 性、特异性或准确性较差，不能及时确诊。近年来，随着核酸杂交、PCR等技 术的应用，犬瘟热的诊断也进入了分子生物学阶段。核酸探针、原位杂交、 RT-PCR以及基因序列分析等方法建立之后，就可对病料中是否含有CDV特异 性核酸进行鉴定，从而提高了犬瘟热诊断的准确性、敏感性和特异性。尽管 目前犬瘟热疫苗灭活苗可以保护大多数免疫动物不被感染发病，但也存在野 毒感染发病的危险。由于疫苗在动物体内存在一定的半衰期，临床上发病初 期检测疫苗免疫动物时，检测到的犬瘟热病毒是疫苗残存还是感染野毒，还 难以确定，从而没有更好的治疗和综合防治措施。因此，区分疫苗株和野毒 株就显得尤为重要。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种区分犬瘟热病毒疫苗株和野毒株的一段序列 和一个酶切位点，有效区分犬瘟热病毒疫苗株和野毒株，为毛皮动物的养殖 提供兽医技术保证。

本发明的技术方案是这样实现的：区分犬瘟热病毒疫苗株和野毒株的一 段序列和一个酶切位点，其特征在于：在CDV犬瘟热结构蛋白核蛋白NP基因 的372-1200位之间，设计引物(P1：5‘TTCTG AGGCA GATGA GTTCT TC3’， P2：5‘CTTGG ATGCT ATTTC TGACA CT3’)RT-PCR扩增特异性片段829bp， 并进行BamHI RFLP分析，可以通过扩增片段的酶切图谱的条带数目来确定所 检测到的CDV属于疫苗株还是野毒株；酶切NP基因目的片段，琼脂糖凝胶电 泳得到675bp和153bp2条带者为疫苗株，得到455bp、220bp和153bp3条 带者为野毒株。

本发明的积极效果是：鉴定方法简单，准确率和效率都很高；河北肃宁 某狐狸养殖场送检的发病狐狸，我们检测犬瘟热阳性，利用该方法扩增到目 的片段829bp片段，并进行RFLP分析，得出该场狐狸感染了野毒，此过程在 6个小时内完成。建议他们隔离发病动物，紧急接种犬瘟热疫苗，病情得到了 很好控制。后来我们进一步用核酸测序的方法验证该扩增序列确实为CDV NP 基因中我们选择的目的序列，并且在预计位点处有预期分析的酶切位点。现 在已经有此种实例23例，其中5个国内外使用的疫苗株，18个不同地区临床 感染野毒实例。选择5个疫苗株及有代表性的5个野毒株列举测序结果，见 序列表。根据我们选择的序列和酶切位点，可在送检病料当天6小时内得出 结果，确定动物体内检测到的犬瘟热病毒类型。

附图说明：

图1为区别犬瘟热疫苗株和野毒株的扩增片段电泳图，野毒株来自 2005-2007年间收集的部分犬瘟热阳性组织病料，疫苗株为收集的国内外临床 上使用的疫苗株；1、19为100bp Ladder DNA Marker；2～14为扩增病料结 果，其中2、3、4、5、7、9、12为犬瘟热阳性；15～18为收集的国内外犬瘟 热疫苗株扩增条带。

图2为区别犬瘟热疫苗株和野毒株的扩增片段的酶切鉴定电泳图，M为 100bp Ladder DNA Marker；1～4为发病脏器中扩增的829bp目的片段RFLP 分析结果，得到3条带：455bp、220bp和153bp，属于CDV野毒株；5～8 为收集的几种国内外犬瘟热疫苗株扩增的目的产物RFLP分析结果，得到2 条带：675bp和153bp。

具体实施方式：

下面实施例对本发明做进一步的描述：

实施例1：

1、引物的设计与合成：

设计合成一对引物P1：5‘TTCTG AGGCA GATGA GTTCT TC3’，P2：5‘CTTGG ATGCT ATTTC TGACA CT3’，预期扩增目的片段大小为829bp。将特产研究所 疫苗株CDV3株中CDV NP基因829片段扩增。