[发明专利]微载体培养重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺

说明书

技术领域

本发明涉及重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体(rhTNK-tPA)的生产新工艺，尤其是公开一种采用Cytopore多孔微载体培养法生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺，以生产rhTNK-tPA，属于细胞培养生产工艺方法技术领域。

背景技术

本发明涉及的rhTNK-tPA可在临床上用于心肌梗死、脑血栓等血栓性疾病的抢救与治疗，是此类疾病抢救与治疗的最新一代特效药物，具有疗效好、安全性高、使用方便及便于抢救等众多优点。由于rhTNK-tPA在临床上用量很大，一般为30-40mg/剂，因此，如工程细胞株的大规模培养技术不能高效表达生产rhTNK-tPA，则rhTNK-tPA产业化将无法进行，使rhTNK-tPA这种优良的药物应用于临床也就没有可能。

目前，rhTNK-tPA在全球只有美国Genentech公司一家生产，其中的工程细胞培养的工艺技术是采用发酵罐悬浮性、批次性的培养法，其缺点是成本很高、工艺操作复杂，且不易扩大生产规模。

发明内容

本发明提供一种微载体培养生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺，克服了现有发酵罐悬浮性、批次性  培养法，成本很高、工艺操作复杂等缺欠，适合于大规模培养及产业化生产。

本发明的技术方案是：

在10L celligen灌注培养系统中采用Cytopore多孔微载体培养rhTNK-tPA的基因工程CHO细胞，以生产rhTNK-tPA。

A、设计和合成基因

将天然tPA第103位的ACG/Thr突变为AAC/Asn(T103N)，再将177位AAC/Asn变为CAA/Gln(N117Q)，再将天然型tPA的296位Lys、297位His、298位Arg和299位Arg全部替换为Ala[KHRR(296-299)AAAA]。

根据天然tPA的cDNA序列，设计了含上述T、N、K突变位点的tPA突变体基因，称之为TNK-tPA。再在基因的上、下游分别引入Xho I和XbaI限制性内切酶位点。基因全长1.7kb。采用全基因人工合成的方法获得基因。

B、构建TNK-tPA真核表达质粒

将人工合成的突变型TNK-tPA基因以Xho I/Xba I双酶切，回收含目的基因的1.7kb的DNA片段，与以Xho I/Xba I双酶切的哺乳动物细胞表达载体pCdhfr连接，转化大肠杆菌E.coli JM109，以载体上的通用引物做PCR初步筛选克隆，得到重组表达质粒pCdhfr-mtPA。

C、转染CHO(DHFR-)细胞，筛选阳性克隆，构建工程细胞株，建立工程细胞库。

D、rhTNK-tPA的基因工程CHO细胞的培养发酵

将冻存的TNK-tPA基因工程CHO细胞株，置水浴中快速融解，将细胞加入培养液，混匀离心，弃上清；细胞沉淀加培养基重新悬浮后，转移至细胞培养瓶中培养，形成致密单层细胞；将上述细胞转入Wheaton搅拌器培养14-18天，达到2×10⁷/mL后，直接转移到Celligen反应器中，采用Cytopore多孔微载体进行培养。培养温度为37℃；pH＝7.1±0.1；溶氧为30～60％范围内；转速：起始转速为20rpm，4小时后逐渐增加转速，接种6小时达到40rpm，补充培养液及新鲜微载体进行培养20天，当细胞浓度达到一定水平后，即可进行收获。

本发明的有益效果在于：采用Cytopore多孔微载体培养TNK-tPA基因工程细胞以生产TNK-tPA，具有细胞密度大、成本低、表达水平高、表达产物比活高的特点，且操作简单，适合于大规模培养及产业化生产。该法细胞密度达到3×10⁷/mL以上，rhTNK-tPA表达水平可达55mg/L以上，培养液的比活可达3.8万IU/mL以上，其纯化物的比活可达50万IU/mg以上。

具体实施方式

实施例

1、材料

1.1多孔微载体

Cytopore微载体为Pharmacia公司产品，基质是纤维素，直径200μm，孔径30μm，膨胀体积为40mL/g。

用前用0.1M、pH7.0的磷酸缓冲液(PBS)浸泡4h后，倾去PBS，再用PBS洗涤3次。121℃高压灭菌30min后，吸出PBS，用DMEN培养基洗两次。

1.2细胞