[发明专利]微载体培养重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺无效
| 申请号： | 200710055742.4 | 申请日： | 2007-06-08 |
| 公开（公告）号： | CN101096655A | 公开（公告）日： | 2008-01-02 |
| 发明（设计）人： | 冯来坤 | 申请（专利权）人： | 冯来坤 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/09 |
| 代理公司： | 吉林长春新纪元专利代理有限责任公司 | 代理人： | 陈宏伟 |
| 地址： | 130062吉林省长春市西安*** | 国省代码： | 吉林;22 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 载体 培养 重组 组织 型纤溶酶原 激活剂 tnk 突变体 工艺 | ||
1、一种微载体培养生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺，在10L celligen灌注培养系统中采用Cytopore多孔微载体培养重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的基因工程CHO细胞。
2、一种微载体培养生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺，包括以下步骤：
A、设计和合成基因
将天然tPA第103位的ACG/Thr突变为AAC/Asn(T103N)，再将177位AAC/Asn变为CAA/Gln(N117Q)，再将天然型tPA的296位Lys、297位His、298位Arg和299位Arg全部替换为Ala[KHRR(296-299)AAAA]；
根据天然tPA的cDNA序列，设计了含上述T、N、K突变位点的tPA突变体基因，称之为TNK-tPA。再在基因的上、下游分别引入Xho I和Xba I限制性内切酶位点，基因全长1.7kb；
B、构建TNK-tPA真核表达质粒
将人工合成的突变型TNK-tPA基因以Xho I/Xba I双酶切，回收含目的基因的1.7kb的DNA片段，与以Xho I/Xba I双酶切的哺乳动物细胞表达载体pCdhfr连接，转化大肠杆菌E.coLi JM109，以载体上的通用引物做PCR初步筛选克隆，得到重组表达质粒pCdhfr-mtPA；
C、转染CHO(DHFR-)细胞，筛选阳性克隆，构建工程细胞株，建立工程细胞库；
D、rhTNK-tPA的基因工程CHO细胞的培养发酵
将冻存的TNK-tPA基因工程CHO细胞株，置水浴中快速融解，将细胞加入培养液，混匀离心，弃上清；细胞沉淀加培养基重新悬浮后，转移至细胞培养瓶中培养，形成致密单层细胞；将上述细胞转入Wheaton搅拌器培养14-18天，达到2×107/mL后，直接转移到Celligen反应器中，采用Cytopore多孔微载体进行培养；培养温度为37℃；pH＝7.1±0.1；溶氧为30～60％范围内；转速：起始转速为20rpm，4小时后逐渐增加转速，接种6小时达到40rpm，补充培养液及新鲜微载体进行培养20天，当细胞浓度达到一定水平后，即可进行收获。
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