[发明专利]农杆菌介导的苜蓿遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及苜蓿遗传转化方法

背景技术

苜蓿的遗传转化研究尽管已经开展了二十多年，但是，建立高效稳定的遗传转化体系一直是制约转基因苜蓿研究和应用的重要因素。在苜蓿的遗传转化中，体胚发生途径是苜蓿再生的主要途径。目前，报道的转基因苜蓿主要通过该途径获得，如Mckersied等(1996)年将Mn-SOD基因应用体胚转化途径转化了苜蓿获得了耐旱的苜蓿。Winicov等(1999)年应用体胚转化途径成功将Alfin1转录因子整合到苜蓿基因组中，获得了耐盐碱苜蓿。体胚再生途径有很多优点，如体胚分化数量大，可以获得大量的转化材料。其次，转化材料中形成嵌合体的几率小，减少后代的筛选纯化工作量。而且，体胚对于抗生素比较敏感，发生抗生素筛选逃逸的材料少等。但是，体胚发生途径也有其一定的弊端，比如体胚发生途径周期长，体胚培养程序复杂，不易掌握，体胚生长状态不均一，高浓度的抗生素严重抑制体胚的发育等。总的来说，体胚发生途径还是适用于苜蓿的遗传转化工作的。体胚发生途径的外植体来源主要包括子叶、真叶和下胚轴等，其中下胚轴和真叶的分化效率最好。研究表明，下胚轴不适合作为农杆菌的直接侵染受体，而下胚轴来源的胚性愈伤组织可以做为农杆菌侵染的优良受体；苜蓿的真叶因其组织体较大，能够对农杆菌有着较强的耐受能力，并且幼嫩的真叶又有较强的分化能力，所以，真叶也是一种优良受体。

发明内容

本发明主要目的是克服苜蓿转化频率低和周期长等制约苜蓿遗传转化效率的技术难题，提高苜蓿的遗传转化效率和缩短遗传转化周期。建立了两种苜蓿遗传转化方法，第一种是超声辅助农杆菌介导转化苜蓿下胚轴胚性愈伤的遗传转化方法，即以苜蓿下胚轴诱导的愈伤组织经过悬浮培养方式，获得高产和生长状态均一的苜蓿胚性愈伤作为转化受体材料，再应用超声辅助农杆菌介导转化胚性愈伤材料，然后在含有抗生素的分化培养基中筛选到具有抗性的体胚，由体胚萌发、发芽、生根，最后获得转化植株。第二种是农杆菌介导转化苜蓿幼嫩真叶遗传转化方法，即以苜蓿幼嫩的真叶作为转化受体材料，用农杆菌介导直接转化真叶，侵染过的真叶在含有抗生素的愈伤诱导培养基中筛选到具有抗性的愈伤组织，然后，将抗性愈伤组织接种到不含有抗生素的分化培养基中诱导出体胚，体胚萌发、发芽、生根，最后获得转化植株。

本发明技术方案是：

1.应用超声辅助农杆菌介导转化苜蓿下胚轴胚性愈伤的遗传转化方法：

1)以苜蓿下胚轴为外植体，在固体诱导培养基中诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织接种到液体诱导愈伤培养基中悬浮培养，诱导出大量的和均一的胚性愈伤；

2)以超声辅助农杆菌介导苜蓿的胚性愈伤，在含有抗生素的分化培养基中筛选到具有抗性的体胚；

3)体胚在萌发培养基中萌发出转化植株；

4)PCR和Southern blot方法检测转基因苜蓿植株。

2.农杆菌介导苜蓿幼嫩真叶遗传转化方法

1)以苜蓿幼嫩的真叶为外植体，农杆菌介导转化真叶，然后在含有抗生素的固体愈伤培养基中诱导出抗性愈伤组织；

2)将抗性愈伤组织接种到不含有抗生素的分化培养基中诱导出成熟的体胚；

3)体胚在萌发培养基中萌发出转化植株；

4)PCR和Southern blot方法检测转基因苜蓿植株。

本发明以苜蓿下胚轴为转化受体，在固体培养基中诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织接种到液体培养基中，悬浮培养出大量的、均一的胚性愈伤组织，再以该组织作为转化受体，以超声辅助农杆菌介导转化该受体。该方法克服了固体培养基培养下胚轴时获得的胚性愈伤不均一的弊端，也显著的提高了苜蓿的遗传转化效率，在超声辅助农杆菌介导转化中，瞬时转化效率可以达到46％，稳定表达效率可以达到15.4％。此外，该方法也显著缩短了苜蓿体胚转化周期，应用常规的直接转化下胚轴愈伤组织获得转化苗大约需要7-8个月的时间，而采用本发明的方法需要为5-6个月，即可以获得大量的转化植株。

本发明以苜蓿真叶为转化受体，经过农杆菌侵染后的真叶在含有较低浓度抗生素的愈伤培养基中诱导出愈伤组织，然后，将愈伤组织转到撤掉抗生素的分化培养基中进行分化。该方法适度的降低了愈伤培养基中的抗生素浓度，缩短了抗性愈伤组织的诱导周期，获得的抗性愈伤组织在不含抗生素的分化培养基中能够很快的分化出体胚来，这使常规的真叶遗传转化周期的7-8个月缩短为5-6个月，而且，真叶的遗传转化效率也高达13.5％。

具体实施方式

实施例1：

应用超声辅助农杆菌介导苜蓿下胚轴遗传转化方法

1材料：