[发明专利]农杆菌介导的苜蓿遗传转化方法

权利要求书

1.农杆菌介导的苜蓿遗传转化方法，其特征是应用超声辅助农杆菌介导苜蓿下胚轴遗传转化方法：

应用材料：

1)苜蓿种子为公主岭1号；

2)菌株和质粒：农杆菌菌株LBA4404和转化载体pBI121均购自北京鼎国生物技术有限公司；含有目的基因：碱蓬的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因SsNHX1的转化载体pBI121由东北师范大学生命科学学院保存和构建，能够公开获得；

具体步骤如下：

1)苜蓿种子首先要经过细砂纸打磨5-6次，然后用75％酒精浸泡处理10分钟，倒掉酒精后用无菌水冲洗3-4次，再用0.1％升汞处理20分钟，倒掉升汞，用无菌水冲洗5-6次，最后将无菌种子接种到成份为Ms盐+3.0％蔗糖+0.58％琼脂，pH5.8的发芽培养基中，在25℃条件下，弱光培养1天；

2)待下胚轴长出时用手术刀将其切下，大约长度为0.5毫米左右，然后将下胚轴接种到成份为Ms盐+UM有机+水解酪蛋白2克+2.4-D 2毫克/L+KT0.25毫克/L+3.0％蔗糖+0.58％琼脂，pH5.8的固体诱导培养基中培养20-30天，当愈伤组织生长成组织密实、颜色浅绿时为宜；

3)将合适的愈伤组织接种到成份为Ms盐+UM有机+水解酪蛋白2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖，pH5.8的液体诱导培养基中悬浮培养，每间隔5-7天换一次新鲜的培养基，摇床转速维持在150转为宜，需要适当补充光照，20-30天时，大量的、均一的胚性愈伤组织生长成熟；

4)在含有目的基因的农杆菌LBA4404平板中挑取单菌落接种到3毫升YEB液体培养基中，过夜培养，再取1毫升转到50毫升的YEB液体培养基中培养，待生长到光密度值为0.6左右时，离心4000转，10分钟，收集菌体，待用； 

5)收集菌体用成份为Ms盐+UM有机+水解酪蛋白2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩尔/升，pH5.8共培养液体培养基50毫升重悬两次；

6)将胚性愈伤组织10个为一批装到2.0毫升的小离心管中，管中盛有成份为Ms盐+UM有机+水解酪蛋白2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩尔/升，pH5.8，600微升的共培养液体培养基，将装有胚性愈伤组织的小离心管放到超声仪中，参数为100mHz处理8秒钟，然后，快速将管中的液体培养基吸出，迅速加入1毫升的农杆菌重悬液，侵染30分钟；

7)将浸染过的胚性愈伤组织平放在成份为Ms盐+UM有机+水解酪蛋白2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩尔/升+0.4％琼脂，pH5.8的半固体共培养基中暗培养3-5天，温度为25℃；

8)将共培养后的胚性愈伤组织接种到成份为Ms盐+NAA0.05毫克/升+6-BA 0.5毫克/升+3.0％蔗糖+头孢霉素300毫克/升+卡那霉素50毫克/升，0.58％琼脂，pH5.8的分化培养基培养50-60天，胚性愈伤组织经过四个胚期生长成成熟的体胚，在此期间每隔20天换一次新鲜的培养基；

9)将成熟的体胚外植体再转入成份为Ms盐+头孢霉素300毫克/升+3.0％蔗糖+0.58琼脂，pH5.8的萌发培养基中萌发，培养条件为25℃，18∶6光周期，20-30天，体胚生长出完整的转化植株，当植株长到10厘米左右时炼苗移栽。

2.农杆菌介导的苜蓿遗传转化方法，其特征是农杆菌介导的苜蓿真叶遗传转化方法：应用材料：

1)苜蓿种子为公主岭1号；

2)菌株和质粒：农杆菌菌株LBA4404和转化载体pBI121均购自北京鼎国生物技术有限公司；含有目的基因：碱蓬的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因SsNHX1的转化载体pBI121由东北师范大学生命科学学院保存和构建，能够公开获得；

具体步骤如下： 

1)苜蓿种子首先要经过细砂纸打磨5-6次，然后用75％酒精浸泡处理10分钟，倒掉酒精后用无菌水冲洗3-4次，再用0.1％升汞处理20分钟，倒掉升汞，用无菌水冲洗5-6次，最后将无菌的种子接种到成份为Ms盐+3.0％蔗糖+0.58％琼脂，pH5.8的发芽培养基中，在25℃条件下，培养4-5天，真叶刚刚展开为宜；

2)在含有目的基因的农杆菌LBA4404平板中挑取单菌落接种到3毫升YEB液体培养基中，过夜培养，再取1毫升转到50毫升的YEB液体培养基中培养，待生长到光密度值为0.6时，离心4000转，10分钟，收集菌体，待用；

3)收集菌体用成份为Ms盐+UM有机+水解酪蛋白2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩尔/升，pH5.8的共培养液体培养基50毫升重悬两次，然后用共培养液体培养基将农杆菌稀释3倍；

4)用剪刀将真叶剪下来，然后将真叶侵染到农杆菌中，侵染30分钟，然后，将侵染过的真叶的远轴面放在成分为Ms盐+UM有机+水解酪蛋白2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩尔/升，0.4％琼脂，pH5.8的半固体共培养基中暗培养3-5天，温度为25℃；

5)将共培养后的真叶接种到含有抗生素的成分为Ms盐+UM有机+水解酪蛋白2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+头孢霉素300毫克/升+卡那霉素30毫克/升，0.58％琼脂，pH5.8的愈伤培养基培养50-60天后，抗性愈伤组织诱导出来，在此期间每隔20天换一次新鲜的培养基；

6)将抗性愈伤组织接种到成分为Ms盐+NAA0.05毫克/升+6-BA 0.5毫克/升+3.0％蔗糖+头孢霉素300毫克/升，0.58％琼脂，pH5.8的分化培养基培养50-60天，胚性愈伤组织经过四个胚期生长成成熟的体胚，在此期间每隔20天换一次新鲜的培养基；

7)将成熟的体胚外植体再转入成分为Ms盐+头孢霉素300毫克/升+3.0％蔗糖+0.58琼脂，pH5.8的萌发培养基中萌发，培养条件为25℃，18∶6光周期，20-30天，体胚生长出完整的转化植株，当植株长到10厘米时炼苗移栽。