[发明专利]重组人抗狂犬病毒抗体

说明书

发明领域

本发明涉及重组单克隆抗体，特别是涉及携带人抗体重链恒定区Fc段的用于筛选、表达人抗体scFv-Fc小分子抗体的通用载体在抗体表达文库中的制备方法及其应用，涉及在巴斯德酵母中表达重组人抗狂犬病毒抗体。

发明背景

抗体分子的突出特点是其功能和分子结构的双重性：识别不同抗原需要数量巨大的结构上的多样性；与体内效应系统相互作用需要结构的恒定性。这一特点使抗体分子成为体内最复杂的分子，长期以来一直是人们研究的热点。

自19世纪末，以抗原免疫动物获得抗血清的途径一直是获得抗体的经典方法。但由于抗血清含有为数众多的各种不同的抗体，其中某些抗体会针对正常组织细胞产生交叉反应而导致严重后果.因此，长期以来抗血清仅用于中和外源性毒素如蛇毒等，而未能应用于其他疾病的治疗。

1975年，及Milstein建立了制备单克隆抗体的B淋巴细胞杂交瘤技术(Nature(London)，256：495，1975)。通过细胞工程可以在体外定向地制备各种单克隆抗体(McAb，以下有时也简称“单抗”)，这在抗体生产中是一个具有划时代意义的进展。特别重要的是，单克隆抗体对相应抗原具有的高度特异性以及抗体分子的均质性可大大降低它在体内与正常组织的交叉反应，为利用抗体治疗疾病带来了新的希望。近20年来，单克隆抗体在疾病诊断方面得到广泛应用，在疾病治疗方面也取得了突破性进展。然而，由于McAb多为鼠源性的，这也大大限制了它作为治疗制剂在人体内的应用。

进入20世纪后，随着整个基因工程抗体技术领域的发展以及抗体基因结构的阐明，DNA重组技术开始应用于抗体的改造，出现了各种各样的基因工程抗体。这些基因工程抗体或消除了天然抗体的一些不利于应用的特性，或增加了新的生物学功能，从而拓展了抗体的应用范围，改善了抗体的应用性能。与鼠源性单克隆抗体相比，基因工程抗体具有许多优点：1)通过基因工程技术的改造，可以最大程度地降低抗体的鼠源性，减少甚至消除人体对抗体的排斥反应；2)基因工程小分子抗体的分子量较小，穿透力强，更易到达病灶的核心部位；3)可以根据治疗的需要，制备多种用途的新型抗体；4)可以采用原核细胞、真核细胞或植物等多种表达体系大量生产抗体分子，大大降低了生产成本。总之，这些基因工程抗体的产生大大增强了单克隆抗体的临床效力，引发了FDA批准治疗性免疫球蛋白和Fab分子上市的浪潮。据统计，目前正处于临床试验中的基因工程抗体约占生物制剂的30％。

80世纪末90年代初噬菌体抗体基因库技术的兴起，使通过大规模富集筛选的方法获得特异性强、亲和力高的基因工程抗体成为可能。但是传统的噬菌体抗体库技术由于是基于原核表达体系的抗体库技术，缺乏对表达产物的翻译后修饰功能，从而降低了获得高亲和力基因工程抗体的可能性，因此对噬菌体抗体库进行富集筛选取时可能存在表达产物亲和力低、活性不稳定甚至难以获得特异性基因工程抗体的问题。所以有必要进一步探索和完善基因工程抗体库的制备技术，努力建立一套适用于真核表达体系的基因工程抗体库表达体系。

狂犬病是由狂犬病毒引起的中枢神经系统感染的世界性人兽共患传染病，人和动物一旦发病其死亡率达100％。据06年9月卫生部公布数字显示，自5月份起，狂犬病已连续4个月成为我国报告死亡数最高的传染病病种。世界卫生组织(WHO)建议目前最有效的暴露后预防措施为联合应用主动及被动免疫，即同时进行疫苗接种并注射狂犬病抗血清。但来源不足、异源蛋白的副作用以及血液制品的潜在致病性都限制了治疗性免疫球蛋白在狂犬病的暴露后治疗中的应用。

随着基因工程技术的发展，基因工程抗体的研制为人们提供了解决问题的新思路。已经有人在大肠杆菌中进行了人源抗狂犬病毒抗体片段Fab和scFv的表达，只是这些小分子抗体还无法完全替代抗血清在体内综合作用，包括抗体依赖的细胞毒性作用和抗体介导的细胞裂解作用等，因此完整的人抗狂犬病免疫球蛋白的生产成为了进一步研究的目标。我们利用本研究室构建的完整人重链及轻链表达载体pPICZαCH和pPICZαCκ(见中国专利，申请号200410010991.8)，以来源于人抗狂犬病毒scFv-Fc小分子抗体文库的特异性单抗RS3为模板，利用分步整合法转化X33酵母菌对抗狂犬病毒抗体进行克隆及表达，制备具狂犬病毒抗原结合活性的完整人源化抗体，以便满足实验室研究的需求，并为狂犬病的治疗与预防大量提供这类治疗剂。

发明目的