[发明专利]一种快速高效构建哺乳动物细胞RNA干扰载体及其验证载体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是基因克隆表达技术，特别是一种快速高效构建哺乳动物细胞RNA干扰载体及其验证载体的方法。特别适合用于大规模的表达针对哺乳动物细胞的不同基因的RNA干扰单元，并对其干扰效果进行测定，用于基因功能研究。

背景资料

后基因组时代，发展能够高通量，并有效的研究基因功能的方法和策略受到人们的迫切关注。RNA干扰技术具有特异性高，操作简便，重复性好的优点，是基因功能研究中的重要手段之一。

目前，常用的构建表达哺乳动物细胞RNA干扰单元载体的方法主要有两种。第一种是寡核苷酸退火法，由化学合成的部分互补，含有干扰目的基因的靶序列的两条寡核苷酸单链，体外条件下退火形成双链DNA，退火产物两端突出的粘性末端，能与处理好的载体的突出末端互补，经连接转化后，得到表达RNA干扰单元的重组质粒。常用的寡核苷酸为一反向重复序列，从这样一个载体转录而来的单链RNA能够回折互补配对，形成发夹结构，在细胞内经处理后形成小干扰RNA(siRNA)而引发RNA干扰效应。第二种是PCR扩增法，设计一对扩增控制RNA干扰单元表达的启动子的PCR引物，正向引物与启动子特异性匹配，反向引物5’末端加上额外针对目的基因的干扰序列，将PCR产物克隆到相应的载体上，得到表达RNA干扰单元的载体。这些方法在一定程度上提高了实验效率，降低了实验成本，但这些方法存在不足，主要表现在以下两方面：

一、步骤繁琐，克隆效率低。这两种方法都需要对克隆的目的片段和载体特殊处理，需要目的片段与载体的连接反应。两种方法中，载体都需要经过合适的酶切、纯化处理。第一种方法需要化学合成的两条寡核苷酸单链体外退火，得到的产物需要纯化处理，然后与处理好的载体连接反应。由于待克隆的目的片段通常小于100bp，因此难以纯化，得率低，而且要鉴定正确的重组质粒较困难，假阳性率高。第二种方法需要在PCR引物中加上针对靶基因的干扰序列，通常需要长引物(通常大于70nt)或者多轮的PCR扩增反应，扩增后的PCR产物也需要与处理好的载体进行连接反应。这个过程不仅花费时间，而且增加了载体自连背景，使后续的筛选阳性克隆的过程复杂化。

二、不适合高通量的操作。两种方法都需要预先处理纯化好待克隆的目的片段，都依赖于载体与片段的连接反应。这些操作对于克隆单个或少数的目的片段可能有效，但要大规模的构建RNA干扰载体却是非常困难的，且效率低下。此外，第一种方法需要使用的寡核苷酸单链通常为60-100nt，第二种方法中使用的引物通常大于70nt，合成这些长的寡核苷酸单链不仅实验成本高，而且碱基合成错误率高。这样就使得筛选正确RNA干扰表达质粒的步骤繁琐，费时费力。

RNA干扰技术已经在生物学众多领域中广泛应用，但是，现在还没有非常合适的方法来设计有效的干扰靶点。对于某一目的基因，一般是选择若干个靶点，平行设计一系列的干扰RNA分子，然后分析测定其干扰的效果。常用的检测RNA干扰水平的方法有实时定量PCR、Northern Blot、Western Blot检测等，为了克服这些方法费时费力且难以大规模使用的不足，有人发展出一种新的方法，即将全长的或部分靶基因与报告基因融合表达，通过检测报告基因的表达量变化而评价目的基因被干扰的程度。但是，这一方法的缺点在于需要有全长或部分的cDNA序列。Quan Du等提出了一种利用含有RNA干扰靶序列的短寡核苷酸与报告基因融合来有效筛选RNA干扰单元的方法，此方法不依赖于cDNA的实物序列，适于高通量的验证RNA干扰效果。目前，构建这种新型RNA干扰验证载体采用的都是寡核苷酸退火法，其主要缺点有以下两点：

一、步骤繁琐，克隆效率低，不适合高通量的操作。化学合成的两条寡核苷酸单链通常小于50nt，体外退火，得到的产物需要纯化处理，然后与处理好的载体连接反应。因此，存在难以纯化，得率低，要鉴定正确的重组质粒较困难，假阳性率高，不适合高通量的操作的缺点。

二、难以构建同时含有多个(大于3个)需验证靶序列的载体。由于针对同一个基因常常设计多个干扰RNA，为了简化实验步骤，可将多个需验证的靶序列构建在同一个验证载体上。利用寡核苷酸退火法，若对于4个以上的RNA干扰靶位点进行验证，所需要的寡核苷酸就会大于80nt，对于更多的靶位点，所需要的寡核苷酸长度就会相应增加。这样，实验成本高，而且寡核苷酸合成的碱基错误率会升高。