[发明专利]一种快速高效构建哺乳动物细胞RNA干扰载体及其验证载体的方法

权利要求书

1.一种快速高效构建哺乳动物细胞RNA干扰载体的方法，特征在于：

1)对RNA干扰载体进行改造，在载体的控制RNA干扰单元表达的启动子与终止信号之间克隆一ccdB基因表达单元，得到表达表达发夹RNA(shorthairpin，shRNA)的RNA干扰骨架载体；

2)引物设计，设计针对目的基因进行RNA干扰的靶序列，根据1)所述的RNA干扰骨架载体的控制RNA干扰单元表达的启动子和终止信号序列，设计一对部分重叠，且带有针对目的基因靶序列的寡核苷酸引物；

3)反向PCR扩增、转化及筛选重组质粒，利用2)所述的引物，以1)所述的RNA干扰骨架载体为模板，进行PCR扩增；PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，PCR产物经同源重组自环化，得到表达目的基因特异性的RNA干扰载体。

2.根据权利要求1所述的快速高效构建哺乳动物细胞RNA干扰载体的方法，其特征在于对于表达类microRNA的RNA干扰载体的构建为：

1)对RNA干扰载体进行改造，是在载体控制RNA干扰单元表达的启动子与终止信号之间的microRNA 5’与3’侧翼序列之间克隆一ccdB基因表达单元，得到表达类microRNA的RNA干扰骨架载体；

2)引物设计，根据5’侧翼序列和3’侧翼序列设计一对部分重叠，且带有针对目的基因靶序列的寡核苷酸引物，同时在两条引物5’末端依次加上干扰目的基因的靶序列和microRNA特异性的环序列，并使得两条引物末端带有10-15nt的重叠区；

3)反向PCR扩增、转化及筛选重组质粒，利用2)所述的引物，以1)所述的RNA干扰骨架载体为模板，进行PCR扩增；扩增的产物，缺失了模板的ccdB基因表达单元，在microRNA的两侧翼序列之间引入了靶和环序列，通过转化大肠杆菌感受态细胞，PCR产物通过同源区重组自环化，得到的重组质粒能够表达类microRNA的RNA干扰单元。

3.根据权利要求1或2所述的快速高效构建哺乳动物细胞RNA干扰载体的方法，其特征在于能够构建表达类microRNA、表达小干扰RNA(smallinterference RNA，siRNA)、表达发夹RNA(shRNA)的干扰载体；或者用于构建由不同启动子控制表达RNA干扰单元的载体，可以是RNA聚合酶III型启动子或者RNA聚合酶II型启动子控制的，组成型或者是诱导型启动子控制的干扰载体，细胞或组织特异性启动子控制的。

4.根据权利要求1或2所述的快速高效构建哺乳动物细胞RNA干扰载体的方法，其特征是用于构建在哺乳动物细胞中表达RNA干扰单元的多种载体，包括质粒表达载体和病毒载体。

5.一种快速高效构建哺乳动物细胞RNA验证载体的方法，特征在于：

1)载体改造，对于已有的表达报告基因的载体，在报告基因与加尾信号(或启动子)之间引入ccdB基因表达单元，得到进行RNA干扰验证的骨架载体；

2)引物设计，根据1)所述的报告基因和终止信号(或启动子)序列，设计一对部分重叠，且含有需验证的靶序列的寡核苷酸引物，同时引物5’末端加上需验证的干扰目的基因的靶序列，并使得引物末端带有相互重叠10-15nt的序列；

3)反向PCR扩增、转化及筛选重组质粒，利用2)所述的引物，以1)所述的RNA干扰验证的骨架载体为模板，进行PGR扩增；扩增的产物，缺失了ccdB基因表达单元，PGR产物转化大肠杆菌感受态细胞，经同源重组自环化，筛选得到靶序列和报告基因融合的RNA干扰验证质粒。

6.根据权利要求5所述的快速高效构建哺乳动物细胞RNA干扰验证载体的方法，其特征在于，该载体可验证的靶序列包括来源于载体表达的和化学合成的siRNA；对于每一个RNA干扰靶位点，与之融合的报告基因是荧光素酶基因，或者是β-半乳糖苷酶基因，或者是氯霉素酰基转移酶CAT基因，或者是碱性磷酸酯酶基因，或者是绿色荧光蛋白基因，或者其它报告基因。

7.根据权利要求5或6所述的快速高效构建哺乳动物细胞RNA干扰验证载体的方法，其特征在于以一个含有报告基因的载体为骨架，可构建出同时含有多个待检测的RNA干扰靶序列的验证载体。

8.根据权利要求1或5所述的快速高效构建哺乳动物细胞RNA干扰载体及其验证载体的方法，其特征在于PCR过程中所使用引物的重叠区长度可以根据实际需要，在5nt～30nt之间调整。