[发明专利]一种快速高通量的基因定点诱变方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是基因操作技术，特别是一种快速高通量的对基因进行修饰的PCR定点诱变方法。特别适用于构建基因缺失，插入和点突变等突变体以研究基因的功能。

背景技术

随着各种物种的基因组计划包括人类基因组计划的完成，发展一种简单快速的定点诱变技术以研究基因和蛋白质的功能受到了人们的迫切关注。目前已有一些公司和研究单位发展了基因定点诱变方法。由于PCR的简单和易操作性，基于PCR的定点诱变方法受到了广大研究者的青睐。基于PCR的定点诱变主要包括重叠延伸PCR法，大引物的方法和反向PCR方法等。第一种是重叠延伸PCR法，这种方法需要设计两个诱变引物，两个侧翼寡核苷酸引物。两个重叠的DNA片段是分别从两个独立的PCR扩增反应得到的。预设突变构建在重叠区域，存于两个扩增片段中。混合重叠片段，用两条侧翼寡核苷酸引物进行第三次PCR扩增，获得全长DNA，然后对诱变DNA片段进行克隆，即三次PCR反应分两个阶段才能构建突变质粒。第二种是大引物的方法，这种方法需要两个侧引物和一个包含预设碱基替换的内部诱变引物。第一轮PCR扩增后的产物作为大引物，同另一侧引物一起进行第二轮PCR，所得产物为包含突变的双链DNA，然后对诱变DNA片段进行克隆，即两轮PCR反应分两个阶段才能得到突变质粒。第三种是反向PCR的方法，这种方法是以反向PCR为基础，以整个带有目的基因的环状质粒为模板，用一对诱变引物进行扩增，最后通过筛选得到带有目的突变的质粒。包括以Stratagene公司为代表的QuickChange^TM快速定点诱变试剂盒，基于DNA体外连接和杂交退火实现带有预定突变的PCR产物自环化的PCR诱变方法以及基于大肠杆菌体内同源重组实现带有预定突变的PCR产物自环化的PCR诱变方法等。这些方法在一定程度上提高了实验效率，降低了实验成本，但也存在不足，主要表现在以下几个方面：

一、前两种方法一般都需要两轮PCR，尽管方法后来有所改进，省去了中间产物的纯化等步骤使得反应能够在同一个管中进行，但是在设计引物时需要考虑在两侧引物中引入酶切位点对PCR后的产物进行克隆，这是定点诱变的限速步骤，耗时耗力，是很不经济的做法。

二、Stratagene公司开发的商品化的QuickChange^TM定点诱变试剂盒因为省去了对PCR后的产物进行克隆的步骤而受到大多数研究者的青睐，它是由一对携带预定突变位点的完全匹配的引物在高保真DNA聚合酶的情况下，反向扩增带有目的基因的质粒载体，然后通过DpnI体外消化甲基化的模板质粒以筛选新合成的含有预定突变的质粒。但是这个方法采用的是两条完全匹配的引物，有以下缺点：(1)PCR扩增效率低；(2)PCR反应对模板质粒的质量和数量都有较大的依赖性，表现在需要制备比较纯的质粒和在PCR反应中加入数量比较多的模板；(3)PCR扩增效率和诱变效率易受到质粒载体大小的影响，表现在较大的质粒载体不易扩增和诱变效率比较低；(4)另外这种方法对点突变比较有效，但是在引入较大的基因插入和缺失突变方面比较困难，限制了此方法的广泛应用。

三、反向PCR的方法可以有效地引入较大的基因插入和基因缺失突变，但是为了实现携有预定突变的PCR产物的环化问题，牵涉到一些体外对PCR产物的处理步骤(包括PCR扩增前需要设计特殊修饰的引物和PCR扩增后对PCR产物通过酶处理或杂交退火的步骤等)。基于大肠杆菌体内同源重组环化PCR产物的方法虽然步骤简单，但是这个方法在设计诱变引物时采用了比较长(25nt)的引物重叠区，需要通过电转化的方式将PCR产物导入大肠杆菌中，另外，它需要通过优化PCR的反应条件才能获得比较高的诱变效率。(参见刊物“Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2001年第三版第13章”；“Nucleic Acids Research 2004年第32卷174页”；“Nucleic Acids Res.1995年第23卷1642-1643页.”；参见网页http://www.stratagene.com)

发明内容

本发明的目的是提供一种快速高通量的基因定点诱变方法，真正能做到简单快速的定点诱变，且不需订购特殊修饰的引物，不需要对PCR后的产物进行任何处理步骤(酶切连接，体外杂交，胶回收和体外DpnI的消化处理等)就能方便迅速地构建突变质粒。

本发明是这样实现的。

一、构建了一个表达DpnI限制性内切酶的DNA腺嘌呤甲基化酶缺陷的用于定点诱变的菌株。