[发明专利]一种快速高通量的基因定点诱变方法

权利要求书

1.一种快速高通量的基因定点诱变方法，其特征在于步骤为：

一、构建了一个表达DpnI限制性内切酶的DNA腺嘌呤甲基化酶缺陷的用于定点诱变的菌株；

首先通过λ-Red重组酶介导的同源重组，用抗性基因替换大肠杆菌染色体上的编码DNA腺嘌呤甲基化酶的基因，得到DNA腺嘌呤甲基化酶缺陷的菌株；其次，用PCR的方法合成了编码DpnI的基因dpnC，并将此基因克隆到温度敏感型的质粒载体上，构建了表达DpnI的质粒；再次，将此质粒转化上述构建的DNA腺嘌呤甲基化酶缺陷的菌株，这样就得到了表达DpnI的DNA腺嘌呤甲基化酶缺陷的菌株；

二、设计部分重叠的PCR诱变引物；

根据需要对基因待突变的位置进行序列分析，合理设计一对PCR诱变引物，分别称为正向诱变引物和反向诱变引物，其中在选定的位点引入了新的预定突变的核苷酸，另外这对引物在5‘端重叠10～16nt，这样通过反向PCR扩增后，得到线形的携有预定突变的产物在末端就会带有10～16nt的同源区，在转化大肠杆菌后，依靠大肠杆菌中不依赖Rec-A的同源重组就可以实现此PCR产物的自环化；

三、反向PCR扩增；

以上述设计的这对PCR诱变引物，对克隆了目的基因的环状质粒模板进行反向PCR扩增；

四、扩增后的PCR产物直接化学法转化上述构建的表达DpnI的DNA腺嘌呤甲基化酶缺陷的菌株，这样经过DpnI体内筛选就可以得到携有预定突变的质粒。

2.根据权利要求1所述的快速高通量的基因定点诱变方法，其特征在于步骤为：

一、构建表达DpnI的DNA腺嘌呤甲基化酶缺陷的菌株E.coli BUNDpnI；

二、设计部分重叠的诱变引物；对克隆了基因thyA的pBluescriptSKII-thyA的DNA序列进行分析，在待缺失的序列位点处设计一对诱变正向诱变引物F1和反向诱变引物R1，R1是与紧接着缺失序列5‘端的序列互补的一段DNA序列，F1包括紧接着缺失序列3‘端的一段DNA序列，另外在这段序列的5’端加上与R1的5‘端15nt的序列互补的序列，使得这对诱变引物在5’端重叠15nt；

引物序列的设计为：

正向引物为：5-‘TAACCTGCAAGATGGCCGTTAAATTCTTCAGAGACGC-3’，

反向引物为：5-‘CCATCTTGCAGGTTAAAACGC-3’；

三、反向PCR扩增及转化；

扩增后的PCR产物进行化学法转化，得到缺失了726个核苷酸的突变质粒。

3.根据权利要求1所述的快速高通量的基因定点诱变方法，其特征在于步骤为：

一、构建表达DpnI的DNA腺嘌呤甲基化酶缺陷的菌株E.coli BUNDpnI；

二、设计部分重叠的诱变引物；

对pBluescript SKII-thyA的DNA序列进行分析，在将要进行点突变的位点处设计一对正向诱变引物F2和反向诱变引物R2，F2和R2均可以与突变位点所在的序列退火，待突变位点处的核苷酸以互补的形式也分别被包括在这对引物中，F2和R2在5‘端重叠15nt，

引物序列的设计为：

正向引物为：5-‘ACTGAACCtGCTcAAAAACGACCC-3’，

反向引物为：5-‘TTgAGCaGGTTCAGTACCGTAGTGA-3’；

三、反向PCR扩增及转化；

扩增后的PCR产物进行化学法转化，得到PvuII酶切位点突变的质粒。