[发明专利]泰乐菌素和替米考星残留检测用单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域。具体涉及一种能同时识别泰乐菌素和替米考星的单克隆抗体 的制备、同时检测泰乐菌素和替米考星多残留酶联免疫分析方法的建立及试剂盒研制。

背景技术

泰乐菌素和替米考星属于大环内酯类动物专用抗生素，在兽医临床上广泛用于治疗革兰氏阳性菌引起的肺 炎、乳房炎、全身性败血症，特别是用于治疗畜禽支原体感染。此外泰乐菌素还广泛用作饲料添加剂。

泰乐菌素和替米考星在动物组织中的残留，会威胁到食品安全，对人类健康造成危害。泰乐菌素和替米考 星易诱导细菌产生耐药性，且耐药性可在细菌之间转移。鉴于此，欧盟在1999年禁止将泰乐菌素用作饲料添加 剂(Council Regulation 2821/98，1998)，中华人民共和国农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》 对泰乐菌素和替米考星在动物性食品中残留也制定了最高残留限量。

现有的检测泰乐菌素和替米考星残留量的方法主要包括微生物方法、仪器分析方法和免疫化学分析方法等。 微生物法虽在残留筛选高通量上表现出良好的性能，但检测耗时长，缺乏特异性，且所用细菌对不同种类的抗 菌药物敏感性存在差异，易导致假阴性和假阳性产生。仪器分析方法的样品前处理复杂，成本高，操作繁琐， 适用于样品的确证分析，而不适用于大批量样品的筛选及现场检测。免疫化学分析法特别是酶联免疫吸附分析 (ELISA)技术具有快速、灵敏度高、操作简单、适应性强等优点，适合高通量样品筛选。因此对于快速检测 泰乐菌素和替米考星在动物组织中的残留，ELISA方法更具优势。

对于小分子化合物ELISA检测方法的建立，小分子化合物的抗体制备是核心部分，而合理设计半抗原又是 关键。半抗原的化学结构的细小差异，连接到载体蛋白上的化学位点的不同，交联臂化学性质的不同均是影响 小分子化合物抗体性质的决定性因素。因此对小分子化合物进行化学结构改造，合理设计半抗原，从不同的位 点以及采用不同的交联臂将半抗原连接到载体蛋白上，构成了该类发明的核心。

申请人检索到与本发明主题相关的专利文献有两篇，其一是美国公开专利，专利号为6,506.885,发明的 名称为Monoclonal antibodies to the drug tilmicosin and amethod for detecting the same。其二为中国发明专利公 开说明书，申请号为200610007286.1，发明的名称为：一种检测泰乐菌素的方法及其专用酶联免疫试剂盒，上 述两件专利文献都只涉及对单一药物的检测。专利号为6,506,885的美国专利公开了一种以替米考星的衍生物 作为半抗原制备的免疫原，获得了一种专门识别替米考星的单克隆抗体。该文献未提供任何关于其创造性的生 物试验数据，以至本领域的技术人员难以达到该发明所述的效果。申请号为200610007286.1中国发明专利申请， 公开了将泰乐菌素和对氨基苯甲酸通过缩合反应合成泰乐菌素半抗原，然后将泰乐菌素半抗原和卵清蛋白采用 混合酸酐法偶联制备免疫原。所制备的单克隆抗体仅能识别泰乐菌素，同时该申请并未具体公开其发明的核心 技术，即作为试剂盒的主要核心试剂如免疫原和包被原的详细制备步骤，使本领域的技术人员难以实施该发明 并达到该发明所称的效果。

发明内容

本发明的目的在丁克服现有技术存在的缺陷，制备一种能同时识别泰乐菌素和替米考星的单克隆抗体。

本发明的第二个目的是利用该单克隆抗体，建立一种能同时检测泰乐菌素和替米考星残留的ELISA方法。

本发明的第三个目的是该单克隆抗体在制备泰乐菌素和替米考星残留检测试剂盒中的应用。

本发明的第四个目的是本发明制备的试剂盒在泰乐菌素和替米考星残留检测中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

为了实现本发明的任务，发明人制备了一种能同时识别泰乐菌素和替米考星的单克隆抗体，它是由保藏号 为CCTCC NO：C200719的杂交瘤细胞株P3C4所分泌的。

上述杂交瘤细胞株P3C4，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：C200719。

所用的免疫原是通过半抗原去碳霉糖泰乐菌素(Desmycosin，DES)与对肼基苯甲酸或己二酰二肼或O-羧 甲基羟胺再与牛血清白蛋白偶联的复合物制备的。