[发明专利]新型耐热植酸酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及植酸酶制备工艺技术，更具体地说，是涉及一种用于动物饲料添加剂的细菌植酸酶的制备工艺技术。

背景技术

植酸酶是催化植酸(肌醇六磷酸)及植酸盐水解成肌醇与磷酸(或磷酸盐)一类酶的总称。在禽畜饲料中添加植酸酶，其作用一是可以使饲料中的肌醇六磷酸(植酸)分解成为肌醇和磷酸，有利于动物消化吸收，使无机磷的用量降低，降低饲料成本；二是可以消除植酸的抗营养作用，提高饲料中矿物元素，如钙、锌、铜、镁和铁等生物学利用率；三是可以提高饲料中蛋白质、氨基酸、淀粉和脂质等营养物质的利用率；四是可以提高动物采食量和日增重，改善动物生产性能；五是可以显著降低猪、禽粪便排泄物中磷的含量。在西方一些发达国家，植酸酶作为动物饲料添加剂被强制使用。

植酸酶作为动物饲料酶加剂所具有的多方面功能逐渐被人们认识，对植酸酶的研究探索不断深入，以期开发生产出性能更好的更适合于作动物饲料添加酶的植酸酶。人们在植酸酶的研究探索过程中，已研究开发出了无花果曲霉菌(Aspergillus fieuum)植酸酶和黑曲酶(A.niger)植酸酶。这两种植酸酶都属于真菌植酸酶，目前都已经商业化生产，被普遍用作动物饲料添加酶。无花果曲霉菌(Aspergillus fieuum)植酸酶和黑曲酶(A.niger)植酸酶作为动物饲料添加酶，对于降低无机磷的用量、提高饲料中矿物元素的生物学利用率和营养物质成分利用率、提高动物采食量和日增重、降低畜禽粪便排泄物中磷含量等方面都有不同程度的改善。但也存在一些问题，其一是不能完全降解饲料中的植酸，会引起三磷酸肌醇和二磷酸肌醇的积累；二是耐热温度不高，80℃植酸酶基本失去活性；三是其最适环境pH值一般为5.5左右，与动物肠道环境pH值相差很大，影响酶的活性。

人们在寻找更适于作动物饲料添加剂植酸酶的研究过程中发现，细菌植酸酶相对于真菌植酸酶更适合于作动物饲料添加酶。为了获得更适于作动物饲料添加剂的新菌植酸酶，人们对来源于大肠杆菌(E.coli)的植酸酶进行了广泛的研究。1993年从大肠杆菌中纯化出植酸酶(appA)之后，研究人员对大肠杆菌植酸酶的基本方面和产品化进行了广泛探索。研究表明，大肠杆菌植酸酶实际上是一种双功能酶，既表现出植酸酶活性，也表现出酸性磷酸酶活性。在大肠杆菌植酸酶产品化研究中，现有技术的水平现状大致如下：陈寅等人将appA通过pET28载体进行表达，获得的appA其最适温度为60℃，最适pH为4.5。Golovan等人研究了appA编码的双功能酶的特点和过量生产，改造后的appA最适温度60℃，在pH为3时显示出最大的耐热性。采用T7聚合酶表达系统以分批发酵方式生产植酸酶，植酸酶产量达到600U/ml。Rodriguez E等人在巴氏毕赤酵母中进行了表达研究。美国专利US6511699采用pT7vector在大肠杆菌中过量表达appA，利用400fold(440mu/mg)增加酸性磷酸酶活性。另外还有报道将appA克隆到pBBRT，转化到假单孢菌，研制了用于植酸酶生产的复合介质，在30℃下培养48小时，分离植酸酶并进行优化，优化的温度和pH分别为55℃和4.0。在30-50℃贮藏2小时，酶的活性有所增加。但直到目前为止，以现有技术制备的大肠杆菌植酸酶，其保持较高酶活力的酸性pH范围还不够宽，与畜禽肠道的环境还不能够完全相适应，还不能实现产业化生产。此外，工业生产植酸酶中，需要经过一个高温制粒阶段，制粒过程中的瞬间高温会造成植酸酶的变性失活。因此，植酸酶的耐热性也是其改造和研究的重要方向。目前开发的植酸酶产品在耐热性能上效果不明显，植酸酶的最适温度在45-50℃之间，在80℃下处理10分钟活性丧失90％以上，基本似活。

发明内容

本发明针对现有技术制备的大肠杆菌植酸酶存在的不足，旨在提供一种新的制备大肠杆菌植酸酶工艺方法，以解决现有技术制备的大肠杆菌植酸酶其保持较高酶活力的酸性pH范围还不够宽，与畜禽肠道的环境还不能够完全相适应，耐热温度还不够高等问题。

上述所要解决的问题可由以下公开的技术方案来解决。

本发明公开的新型耐热植酸酶的制备方法，主要包括以下工艺步骤：

(1)基因富集：将大肠杆菌SUGL用LB培养基进行培养，提取大肠杆菌SUGL的基因；

(2)扩增反应：以大肠杆菌SUGL的基因组为模板，用Taq DNA聚合酶进行PCR反应；