[发明专利]新型耐热植酸酶的制备方法

权利要求书

1.一种新型耐热植酸酶的制备方法，其特征在于主要包括以下工艺步骤：

(1)基因富集：将大肠杆菌SUGL用LB培养基进行培养，提取大肠杆菌SUGL的基因；

(2)扩增反应：以大肠杆菌SUGL的基因组为模板，用Taq DNA聚合酶进行PCR反应；

(3)酶切连接：PCR产物用限制性内切酶KpnI和XhoI双酶切，将双酶切目标片段插入经相同限制性内切酶双酶切后的含有以硫氧还原蛋白为融合蛋白的表达载体，再将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，从转化后的大肠杆菌中提取质粒pET32-appA；

(4)接种培养：将含有重组表达质粒pET32-appA的BL21(DE3)单菌落接种于LB培养基中培养，在其培养至对数生长期加入诱导剂IPTG诱导培养，制备得到植酸酶。

2.根据权利要求1所述的新型耐热植酸酶的制备方法，其特征在于扩增反应结束后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定回收目的片段。

3.根据权利要求1所述的新型耐热植酸酶的制备方法，其特征在于诱导培养结束后，对制备的植酸酶菌体进行离心分离、超声波破碎和电泳鉴定。

4.根据权利要求3所述的新型耐热植酸酶的制备方法，其特征在于超声波破碎的操作条件为：450W，工作9s，间歇3s，持续20min。

5.根据权利要求3所述的新型耐热植酸酶的制备方法，其特征在于对离心分离得到的上清液和沉淀实施SDS-PAGE电泳鉴定。

6.根据权利要求1至5中的任一项权利要求所述的新型耐热植酸酶的制备方法，其特征在于PCR反应所选用的聚合酶为Ex Taq DNA。

7.根据权利要求1至5中的任一项权利要求所述的新型耐热植酸酶的制备方法，其特征在于PCR扩增反应过程的操作为：93-95℃变性处理3-65min；以94℃45s、58℃60s、72℃90s条件循环29-40次；72℃延伸处理10min。

8.根据权利要求1至5中的任一项权利要求所述的新型耐热植酸酶的制备方法，其特征在于PCR产物用限制性内切酶KpnI和XhoI双酶切成的目的片段长为1.3kb，酶切连接所选用的表达载体为pET-32a(+)。

9.根据权利要求1至5中的任一项权利要求所述的新型耐热植酸酶的制备方法，其特征在于单菌落接种于LB培养基中培养至OD600＝0.60-0.80时加入诱导剂IPTG，诱导剂IPTG的加入量终浓度为0.1-0.5mmol/mL。

10.根据权利要求1至5中的任一项权利要求所述的新型耐热植酸酶的制备方法，其特征在于大肠杆菌SUGL和含有重组表达质粒pET32-appA的BL21(DE3)单菌落在LB培养基中进行培养的条件为：在37℃，220rpm下振荡培养过夜。