[发明专利]水稻OsPT6:1基因编码序列及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，具体涉及一种从水稻中克隆出高亲和磷酸盐转运蛋白基因(水稻高亲和磷酸盐转运蛋白，high affinity phosphate transporter，OsPT6:1)以及拷贝数分析，基因表达模式分析，酵母表达载体的构建，电击转化，同源重组细胞的获得以及相应的生理生化特性的鉴定。

背景技术

土壤缺磷是世界范围内普遍存在的问题。据统计，全世界有43％的耕地存在不同程度的缺磷问题，我国有2/3的耕地缺磷(刘建中等，1994)。因此土壤缺磷是我国及世界农业生产中限制作物产量的一个重要因子，提高缺磷土壤中作物生产力的研究工作倍受关注。

解决这一问题主要从两方面着手：一是提高土壤的磷素含量，二是提高植物自身吸收磷的能力。提高耕地土壤磷素含量的目的，主要通过施加磷肥来实现。但是，我国磷矿资源并不丰富；磷肥施入土壤后易被石灰性土壤中钙盐及酸性土壤中的铁、铝氢氧化物固定或被土壤胶体吸附转化为难溶性磷，并不易于植物吸收(张福锁等，1993)，磷利用效率很低；；增加磷肥施入量，还可能造成江河湖泊富营养化、环境污染加重等弊端。提高植物自身吸收磷的能力，主要就是利用生物学的方法，挖掘作物高效吸收利用土壤磷素的遗传潜力、培育适应低磷胁迫的作物品种。农业可持续发展要求高效益、低投入、少污染，因此这是提高缺磷土壤中作物生产力的经济有效的途径之一。

水稻是我国乃至世界的主要粮食作物，水稻产量占粮食总产的44％(1987年数据)(李庆逵，1989)。我国水稻耕地主要分布于秦岭-淮河一线以南、青藏高原以东的长江流域和华南地区，其面积约占全国水稻土的93％；但是这些地区多为酸性和微酸性土壤，土壤中磷素形态主要是磷酸铁，此种形态的磷难于被作物吸收。水稻土磷肥短缺的现状，大大限制了水稻产量，因而改善水稻磷营养特性，对于提高水稻产量意义重大。

本发明研究了一种从水稻中获得编码磷酸盐转运蛋白的cDNA，研究该基因的表达模式及初步功能，明确该基因在植物耐低磷反应中的具体作用，通过同源重组技术可以提高酵母突变体对磷素的吸收能力，可以使植物在低磷环境下正常生长，扩大植物(如水稻)等的栽培范围。

在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的水稻OsPT6:1序列及其核酸序列。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种新的水稻基因OsPT6:1，该基因是一个高亲和磷酸盐转运蛋白基因。

本发明的另一目的是提供这种水稻蛋白OsPT6:1编码序列在利用同源重组技术提高酵母磷酸盐吸收，以及在改良植物对低磷耐受性方面的应用。

本发明一方面提供一种新的水稻基因，是一种具有特定序列的DNA分子，其编码水稻高亲和磷酸盐转运蛋白的开放阅读框，具体见SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

本发明的另一方面还提供由上述基因翻译出的蛋白质分子，是一种上述序列编码的具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。

本发明还提供了一种利用同源重组技术将编码具有水稻OsPT6:1活性的核苷酸序列转化入酵母细胞以提高磷酸盐吸收的方法，其步骤如下：

(1)将水稻OsPT6:1基因的开放读框可操作地连接于酵母表达调控序列，形成含有水稻OsPT6:1基因(SEQ ID NO.1的核苷酸序列)的表达载体；

(2)将步骤(1)中的表达载体通过电击法转入酵母；

(3)通过抗生素筛选，PCR鉴定，获得水稻OsPT6:1基因的转化细胞。含有水稻OsPT6:1基因的酵母磷酸盐吸收能力有较大程度的提高。

本发明还提供了一种检测样品中水稻高亲和磷酸盐转运蛋白拷贝数的方法，它包括用SEQ ID NO.1所示序列与样品杂交，然后检测探针是否发生了结合。该样品是水稻基因组DNA，经限制性内切酶酶切后的核苷酸序列。

本发明还提供了一种用于检测OsPT6:1基因在水稻原植株组织中表达分布状况的方法。取小块组织材料，经多聚甲醛处理和梯度脱水，包埋于石蜡组织中。实验检测时取复水和蛋白酶K处理过的切片与事先制备的DNA探针分子在杂交液中混合杂交，显色后观察拍照。而杂交使用的DNA探针分子为包含于OsPT6:1基因的某特异区段的DNA序列。

本发明的水稻OsPT6:1蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物。