[发明专利]一种快速筛选牛奶类液体样中抗菌药物残留的方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗菌药物残留检测分析技术领域，具体地说属于一种利用细菌的生长受到被检样品中残留的抗菌药物抑制而快速筛选牛奶类液体样品中抗菌药物残留的方法。

背景技术

抗菌药物残留一直是困扰食品安全的严重问题，奶牛养殖场广泛应用抗菌药物治疗各种感染性疾病因而容易造成牛奶中的药物残留。现在用于检测牛奶中抗菌药物的方法主要有高效液相色谱法、液相-质谱联用分析法、气相-质谱联用分析法、薄层色谱法等色谱方法。这些色谱方法存在的主要缺陷是：需要专业仪器设备；样品预处理程序繁琐；操作过程复杂；耗时冗长；需要专业培训的技术人员进行操作；干扰因素多；分析仪器昂贵；在基层难以普及，一般只适用于实验室检测；检测费用高。免疫学检测法也用于抗菌药物在牛奶中的残留检测，但一种试剂盒一般只能检测一种抗菌药物、易受干扰而出假阳性，耗材成本高。

微生物法检测抗菌药物残留是根据抗菌药物对微生物的生理机能、代谢的抑制作用，来定性或定量确定样品中药物残留，具有快速、敏感、廉价等优点。目前，牛奶等液体样的抗菌药物残留微生物检测法主要有氯化三苯基四氮唑法，并已列入国家标准。但该方法的具体操作过程中，加入检测牛奶中的嗜热链球菌的数量会对检测结果影响很大，会产生假阴性或假阳性结果，同时其检测时间也较长，好事费力。因此，开发廉价、敏感度高、能快速检测牛奶等液体样品，且非专业人员可操作，结果可信的微生物法残留检测筛选方法成为急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术在推广使用过程中存在的上述缺陷，提供一种不需要特定大型分析仪器设备，具有灵敏度高、可信度高、使用方法简单的筛选方法，使其能有效降低牛奶等液体样品中抗菌药物残留的检测成本，减轻需检测单位的负担，适于基层推广。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种快速筛选牛奶类液体样中抗菌药物残留的方法，特点是：它包括制备检测用液体培养基、制备含有细菌芽孢和酸碱指示剂的琼脂培养基检测管及筛选，其具体步骤如下：

(1)、制备检测用液体培养基

取0.6％～1.5％蛋白胨、0.4％～1.0％胰蛋白胨、0.15％～0.4％牛肉浸膏、0.4％～0.8％葡萄糖、0％～1.0％酵母浸高、1.0％～2.0％氯化钠、1.0％～2.0％牛奶粉，加去离子水补足总体积为100％，混匀后每1000mL前述溶液再添加含0.5％氯化钙、0.25％氯化钠、0.25％氯化钾的无机盐溶液20～40mL，6μg/mL的甲氧苄氨嘧啶溶液30～60mL，混匀后调pH为6.8～7.6，在115℃灭菌30分钟，冷却后在0～4℃保存备用。

(2)、制备含有细菌芽孢和酸碱指示剂的琼脂培养基检测管

a、制作芽孢率达85％以上的芽孢菌液

芽孢杆菌在含有1％胰蛋白胨、0.5％酵母浸膏、0.2％K₂HPO₄，pH 7.2的液体培养基中55℃培养18～20h，然后转种于含0.2～0.3％牛肉浸膏、0.4～0.5％蛋白胨、0.3～0.4％酵母浸膏、50～200mg/L的MnCl₂.4H₂O、2％琼脂，pH7.2的固体培养基50～60℃培养3～7天；芽孢染色镜检，当芽孢率在85％以上时，用4℃无菌去离子水洗下并置于90℃水浴锅中加热灭活20分钟；5000rpm离心20分钟，弃去上清液，灭菌去离子水重新漂浮，重复离心洗涤两次。最后的沉降物用4℃无菌去离子水漂浮，细菌计数后得芽孢菌液。

b、酸碱指示剂与琼脂混合，加入去离子水，使酸碱指示剂和琼脂浓度分别达到50～100μg/mL和1.5～2％，混匀调pH7.0～7.2，并115℃灭菌30分钟。

c、灭菌完毕后使琼脂冷却至55～75℃时，迅速加入已计数的芽孢菌液，使芽孢含量达1×10⁶cfu/mL～1×10⁸cfu/mL，立即充分混匀并分装于竖直状态的无菌管中；每支管加入50～400μL琼脂，使管内琼脂厚度达0.2～0.6厘米，竖直状态自然凝固后密封并于0～4℃冷藏备用。

(3)、筛选

用移液管I将50～200μL牛奶类液体样加入到含有细菌芽孢和酸碱指示剂的琼脂培养基检测管，再用移液管II向琼脂培养基检测管加入50～200μL检测用液体培养基，将琼脂培养基检测管竖直置于55℃～70℃培养1.5～4小时后，根据琼脂培养基检测管内固体琼脂培养基颜色变化的性质及程度筛选出含有抗菌药物残留的样品。