[发明专利]重组α－葡聚糖酶融合蛋白高效生产方法及相关表达载体和菌株

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及α-葡聚糖酶的生产方法，特别是指一种重组α-葡聚糖酶融合蛋白高效生产方法，及相关表达载体和菌株。

背景技术

根据国际生物化学与分子生物学命名委员会，葡聚糖酶分为5类：葡聚糖酶(EC3.2.1.11)，葡聚糖-1，6-α-D-葡糖苷酶(EC 3.2.1.70)，葡聚糖-1，6-α-D-异麦芽糖酶(EC 3.2.1.94)，葡聚糖-1，6-α-D-异麦芽三糖酶(EC 3.2.1.95)和支链-葡聚糖外切1，-α--糖苷酶(EC 3.2.1.115)。

很多真菌，如曲霉、薄毛壳酶、镰刀酶、油脂酵母、拟青霉、和青霉类等都可以产生葡聚糖酶。它们产生的这些酶均为内葡聚糖酶，特异地作用于葡聚糖内α-(1→6)-键，作用后主要生成异麦芽糖或异麦芽三糖。已有报道，许多细菌链球菌、假单胞菌、大环杆菌等也可以产生胞外葡聚糖内切酶。如球形节杆菌产生异麦芽糖葡聚糖酶，这是一种可以从葡聚糖和寡糖的非还原末端连续的释放出异麦芽糖的外葡聚糖酶。该酶不仅能够识别α-(1→6)-糖苷键，还能识别α-(1→2)-、α-(1→3)-和α-(1→4)-糖苷键。同时，一些Bacteroides oralis IG、Arthrobacter globiforms I-42、Pseudomonassp.、Streptococcus mitis也能产生外切葡聚糖酶。

由于蔗糖是形成葡聚糖的天然底物，所以在含糖食品的生产中，葡聚糖污染是一个很大的问题。因为葡聚糖会阻塞过滤装置而防碍糖特别是甘蔗的结晶。当原液中葡聚糖含量低至如75mg/L时，过滤效率仍能降低50％左右。目前，工业上已成功用细丽毛壳霉和青霉菌生产的葡聚糖酶来解决糖加工过程中的葡聚糖污染问题，含量为10ppm/50L的葡聚糖酶就能使过滤效率恢复到90％的正常水平。

此外，葡聚糖酶在牙齿保健方面也具有重要的应用价值，它能有效地阻止牙菌斑的形成，从而达到防治包括蛀牙、牙龈炎和牙周炎等多种口腔疾病的功效。M.Marotta的研究表明，商业用酶Dextranase 50L在浓度为3.75×10^-2-1.5×10^-1U/L范围内能有效的抑制口腔中葡聚糖的合成同时抑制蔗糖的黏附，对消除早期形成的由蔗糖沉积引起的生物膜起到了良好的预防效果。

我国对葡聚糖酶的需求潜力很大，但目前产量较低，且酶种数量较少。迄今为止，达到生产规模的酶制剂只有α-淀粉酶、糖化酶和碱性蛋白酶，所以需要加大投入和研究开发。这些研究的成功将促进葡聚糖酶在酒精、发酵、饲料、制糖等产业的广泛应用，因而具有广阔的开发应用前景。

目前，国际上商业用葡聚糖酶大多来源于青霉菌(Penicillium minioluteum)和Chaetomiunm sp.，而油脂酵母是一种产子囊酵母，也可以产生葡聚糖酶。关于油脂酵母产葡聚糖酶的研究从1989年Koenig D分离了分子量为74KDa，71KDa，68KDa，65KDa的葡聚糖酶开始，有了一系列的研究。在此基础上，David W通过添加诱导物1-O-，Methyl-glucopyranoside在发酵12h后达到最大的酶活。1993年Day，Donal F，KimD利用Lipomyces starkeyi ATCC 74054和Leuconostoc mesenteroides在工业化生产上的联合培养获得一定分子量的葡聚糖酶并申报了专利。寥威、周河治等从土壤中分离出的一株产葡聚糖酶酶活31U/ml的野生菌株SB12，经UV、⁶⁰Co、LiCl诱变筛选后得到了产葡聚糖酶高产菌株SB126，经优化发酵转速、pH值、温度、接种量和发酵时间等发酵条件后，检测酶活达到70U/ml，较野生菌株提高了近两倍。青霉菌葡聚糖酶在毕赤酵母中重组表达，产量达到了3.2g/L。

目前，关于葡聚糖酶的分离纯化方法主要还是采用盐和PEG沉淀、萃取法和色谱法等。Dipak K，Sadhan K等用磷酸钙凝胶色谱从Penicillium lilacinum中分离出了分子量大小为26KDa的葡聚糖酶。C.V.A.Wynter，M.Chang等从厌氧细菌Rt364中分离了具热稳定性的葡聚糖酶，通过硫酸胺沉淀，离子交换，疏水层析和分子排阻色谱分离纯化了分子量大小为140KDa的葡聚糖酶。Elvira Khalikova，Petri Susi等对Bacillus sp.分泌的葡聚糖酶粗酶液用硫酸胺和PEG沉淀，酶活提高了733倍，经过阴离子交换柱和亲和吸附，总酶产率为19％。