[发明专利]重组α－葡聚糖酶融合蛋白高效生产方法及相关表达载体和菌株

权利要求书

1.一种高效生产α-葡聚糖酶融合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.在适合的表达条件下，培养一酵母工程细胞，所述酵母工程细胞整合有内含编码所述α-葡聚糖酶融合蛋白的核苷酸序列的酵母分泌表达载体，所述核苷酸序列编码的蛋白包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，从而分泌表达出所述α-葡聚糖酶融合蛋白；

b.分离纯化出表达的所述α-葡聚糖酶融合蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母工程细胞是毕赤酵母工程细胞，所述核苷酸序列是SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，所述酵母分泌表达载体是pPIC9k中整合了所述核苷酸序列的pdex-9k-His。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a的所述表达条件为：分为培养阶段和诱导阶段，溶氧维持在30％，温度保持在25～28℃，培养阶段培养至发酵罐中甘油基本耗尽时，流加50％甘油，持续6小时，进入诱导阶段，流加100％甲醇诱导，甲醇终浓度在1‰～2‰，诱导pH为6.0。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b包括步骤：

(1)发酵液通过简单离心或超滤获得含有目的蛋白的上清液；

(2)通过简单的SP-sephrose阳离子交换和Ni亲和层析，即可获得纯度在95％以上的纯品。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述SP-sephrose阳离子交换的缓冲液的pH值为4.0，所述Ni亲和层析的缓冲液的pH值为6.5。

6.一种酵母分泌表达载体，其特征在于，所述酵母分泌表达载体含有编码α-葡聚糖酶融合蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码的蛋白包含SEQ ID NO：2和SEQID NO：4所示的氨基酸序列。

7.如权利要求6所述的酵母分泌表达载体，其特征在于，所述核苷酸序列的编码区包含与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列有95％以上相同性的序列和与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列有95％以上相同性的序列。

8.如权利要求7所述的酵母分泌表达载体，其特征在于，所述核苷酸序列是SEQ IDNO：5所示核苷酸序列，所述酵母分泌表达载体是pPIC9k中整合了所述核苷酸序列的pdex-9k-His。

9.一种酵母工程细胞，其特征在于，所述酵母工程细胞整合有权利要求6所述的酵母分泌表达载体。

10.如权利要求9所述的酵母工程细胞，其特征在于，所述酵母工程细胞是毕赤酵母工程细胞。