[发明专利]一种溶菌酶的发酵方法

说明书

技术领域

本发明属于遗传工程和蛋白质工程领域，具体涉及一种溶菌酶的发酵方法。

背景技术

溶菌酶是一种碱性球蛋白，全称为：1，4-β-N-溶菌酶或者：粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它能水解细菌细胞壁的肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1，4糖苷键，破坏肽聚糖支架，在细菌内部渗透压作用下导致细胞壁破裂，达到杀菌效果。

在临床上，溶菌酶对眼、耳、鼻、喉、口腔等的急、慢性炎症均有一定疗效，特别是对急性炎症如：急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明显。与抗生素联合使用，对于严重的急性炎症亦有一定疗效。在治疗皮肤病方面，溶菌酶亦有广泛用途，可用于治疗扁平疣、传染性软疣、寻常性疣、尖锐湿疣、带状疱疹等多种皮肤病。对于带状疱疹，内服溶菌酶即可。此外，溶菌酶可用于小儿或乳儿哮喘性支气管炎、呼吸道内膜肿胀等，能够使黏膜肿胀很快消除，使痰液变稀、呼吸通畅。溶菌酶亦可预防和治疗病毒性肝炎，尤其对输血后肝炎及急性肝炎的效果较为显著。在机体内溶菌酶还具有抗流感病毒的活性，其与胆酸盐酸盐的复合物能强烈抑制流感病毒和腺病毒的生长，并能防止疱疹性病毒感染。

目前，在临床上应用的溶菌酶主要是蛋清溶菌酶，由于其是一种异源蛋白，在人体内会产生免疫原性和毒副作用。而从人奶、胎盘或尿液中少量提取溶菌酶，来源极其困难，无法进行工业化生产。并且从生物材料提取溶菌酶有其固有缺陷，一是受生物材料来源限制，二是生物材料由于取自不同生物体，保鲜程度不一，易受病毒和其他有害物质污染，这会造成产品质量不稳定。且天然溶菌酶价格昂贵，因此无法用于临床。

迄今，国内尚无溶菌酶的规模生产。各实验室使用的溶菌酶大多为进口产品，随着对溶菌酶的临床应用研究的深入，国内迫切需要质优价廉的溶菌酶供应。

发明内容

本发明目的是对溶菌酶的发酵方法进行优化，使溶菌酶的产量稳定于较高水平，从而达到规模生产要求。

本发明提供了一种溶菌酶的发酵方法，该方法包括以下步骤：

(1)将活化的表达溶菌酶蛋白的毕赤酵母菌种置于培养基中发酵1-3天；

(2)在(1)的培养基中加入甲醇，继续培养1-5天；

(3)收集发酵产物，去菌体，即可。

本发明中，表达溶菌酶蛋白的毕赤酵母菌种可以采用基因工程将溶菌酶基因序列插入毕赤酵母的基因组而得。溶菌酶基因序列可以采用从适当的生物体组织细胞中提取或者人工合成而得。通常，使用的溶菌酶基因序列是经过偏爱密码子改造的，即将溶菌酶基因序列中的密码子序列改为毕赤酵母的偏爱密码子。

由于品质优良的菌种通常被冷冻保存，以备后用，所以发酵前要将菌种活化。菌种活化可以采用常规的方法进行，例如，室温复苏，稀释涂布于固体培养基上培养过夜，然后挑取菌落接种液体培养基培养备用。

本发明中，发酵培养基可以使用常规培养基。其中，该培养基中甘油含量为5-40ml/L，蛋白胨含量为10-50g/L。培养基中还可以加入酵母粉，酵母粉的含量为0-50g/L。培养基中还可以加入葡萄糖，葡萄糖的含量为0-40g/L。培养基中还可以加入磷酸盐，磷酸盐含量为0-0.1M/L。磷酸盐可以是磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液。该培养基在pH值为7-8.5时效果较好。

本发明中，发酵温度可以采用常温。

本发明中，步骤(2)中发酵时间为36-60小时。

本发明中，步骤(2)中加入甲醇的量为每6-15小时添加甲醇0.25-15ml/L培养基。例如，每6、8、10、12或者15小时添加一次；添加甲醇的量可以是每次0.2ml/L，1ml/L，2ml/L，4ml/L，5ml/L，7ml/L，8ml/L等，但要保证甲醇的浓度在培养基中不超过3％的体积比。

本发明中，步骤(2)培养过程中加入含蛋白胨0.01-0.05g/ml和酵母提取物，即酵母粉，0.01-0.05g/ml的培养基。

本发明中，步骤(3)中去菌体方法可以为离心或者过滤、超滤。

本发明中，以离心方法为去菌方法时，离心条件可以为1500-10000rpm，3-15分钟，0-10℃。

由于溶菌酶为分泌蛋白，所以溶解在发酵产物上清中。