[发明专利]盐藻26S蛋白酶体亚基RPT2基因的cDNA序列、其编码蛋白及其全长基因序列和克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种盐藻(Dunaliella viridis)中26S蛋白酶体亚基RPT2基因(DvRPT2)的cDNA序列、其编码蛋白以及全长基因序列和克隆方法。

背景技术

盐藻，又叫杜氏藻，它是一种无细胞壁的单细胞真核绿藻，是已知的最耐盐的真核生物。同时，它对光照、环境pH、温度等变化造成的胁迫也能够很好的耐受。因而被广泛的用来研究植物对各种胁迫的反应机制，特别是耐盐胁迫的机制。

泛素/26S蛋白酶体蛋白质降解途径(ubiquitin/26S proteasome pathway)是真核细胞中蛋白质的选择性降解中一种非常重要的机制。因其高效的降解细胞内蛋白的能力，参与了真核细胞调控的各个方面。26S蛋白酶体的6个ATP酶亚基含有AAA-ATPase调控结构域，形成了一个独特的AAA家族。ATP酶活性是蛋白降解过程中必不可少的，参与了蛋白酶体的组装和底物的有效识别和去折叠。ATP酶组件是由200～250个氨基酸构成的保守序列，是AAA家族蛋白的主要功能区域，其中包含有ATP结合基序(又称Walker A Box，P2loop)“Gx4GKT”和ATP水解基序(或称walker B Box)“DEID”两个特征性结构域。此外，这6个亚基还还具有RNA/DNA螺旋酶的特征性基序“SAT，H/QRxGRxxR”等功能基序。

到目前为止，6个RPT亚基的精确功能仍然不很清楚。在它们被鉴定为26S蛋白酶体的组成因子之前，被认为参与了许多不同的并似乎互不相关的功能，比如细胞周期的调控；，基因表达，病毒侵染以及受体互作等。在酵母中，每一个RPT基因都是必须的。其中RPT2由于其在某些方面的功能最令人关注。它在生物体进化的过程中高度保守，酵母对这个亚基的突变非常敏感，即使是保守替换其活性位点(lysineK229)也会引起致死。Alwin Kohler等证实26S蛋白酶体CP的中心内腔的开启也是由RPT2所介导的，对蛋白质的体内降解具有调节的作用。

许多研究表明泛素/26S蛋白酶体途径参与了多种环境胁迫和激素的应答。比如，在拟南芥的研究中，Smalle等发现RPN12与细胞分裂数的生长应答有关，参与了稳定了一个或多个细胞分裂素调控因子；而RPN10可能参与了底物专一性功能，在调节脱落酸信号传到的过程中起到了十分重要的作用。此外，RPN10还是Physcomitrellapatens生长发育所必须的。在盐藻和水稻的蛋白组学的研究中人们发现：在高渗的环境下，26S蛋白酶体调控亚基的表达有所上调，这就说明蛋白酶体调控体系在调节渗透胁迫信号传到的过程中起重要作用。

发明内容

本发明的目的之一在于提供盐藻26S蛋白酶体亚基RPT2基因(DvRPT2)全长编码区序列。

本发明的目的之二在于提供该序列编码的氨基酸序列。

本发明的目的之三在于提供盐藻26S蛋白酶体亚基RPT2基因(DvRPT2)的全长基因序列。

本发明的目的之四在于提供该DvRPT2基因的克隆方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种盐藻26S蛋白酶体亚基RPT2基因的cDNA序列，其特征在于该序列具有SEQ NO 1所示的碱基序列。

上述的cDNA序列编码的蛋白，其特征在于具有SEQ NO 2所示的氨基酸序列。

一种盐藻26S蛋白酶体亚基RPT2基因的全长基因序列，其特征在于具有SEQ NO3所示的碱基序列。

上述的盐藻26S蛋白酶体亚基RPT2基因的全长基因序列的克隆方法，其特征在于该方法具有如下步骤：

a.利用限制性内切酶EcoR I/Xho I消化含有DvRPT2的盐藻EST文库质粒释放出目的片段，获得26S蛋白酶体亚基RPT2基因全长cDNA序列；

b.根据上述的cDNA序列设计引物筛选藻基因组BAC文库，得到盐藻26S蛋白酶体亚基RPT2基因的基因组BAC克隆，利用QIAGEN公司的Large-ConstructKit抽提无大肠杆菌基因组污染的BAC质粒，回收的DNA经机械破碎后，回收大小在2～4kb的DNA片段，连接到pUC18载体，构建鸟枪文库；所述的筛库引物序列为：

RPT2P2a：5′ CCCTGTGAGACTGACTTGAGA  3′

RPT2P2b：5′AGCTTGCACTTGGCTGTG  3′