[发明专利]盐藻26S蛋白酶体亚基RPT2基因的cDNA序列、其编码蛋白及其全长基因序列和克隆方法

权利要求书

1.一种盐藻26S蛋白酶体亚基RPT2基因的cDNA序列，其特征在于该序列具有SEQ NO 1所示的碱基序列。

2.一种根据权利要求1所述的cDNA序列编码的蛋白，其特征在于具有SEQ NO 2所示的氨基酸序列。

3.一种盐藻26S蛋白酶体亚基RPT2基因的全长基因序列，其特征在于具有SEQ NO3所示的碱基序列。

4.一种根据权利要求3所述的盐藻26S蛋白酶体亚基RPT2基因的全长基因序列的克隆方法，其特征在于该方法具有如下步骤：

a.利用限制性内切酶EcoR I/Xho I消化含有DvRPT2的盐藻EST文库质粒释放出目的片段，获得26S蛋白酶体亚基RPT2基因全长cDNA序列；

b.根据上述的cDNA序列设计引物筛选藻基因组BAC文库，得到盐藻26S蛋白酶体亚基RPT2基因的基因组BAC克隆，利用QIAGEN公司的Large-ConstructKit抽提无大肠杆菌基因组污染的BAC质粒，回收的DNA经机械破碎后，回收大小在2～4kb的DNA片段，连接到pUC18载体，构建鸟枪文库；所述的引物序列为：

RPT2P2a：5′CCCTGTGAGACTGACTTGAGA  3′

RPT2P2b：5′AGCTTGCACTTGGCTGTG  3′

c.大通量提取鸟枪文库的质粒DNA，在MegaBACE 4500上进行序列的测定；

每个鸟枪质粒利用M13正反向引物，进行双向测序。共测序384个鸟枪文库质粒，即4块96孔板

d.将上述的384个鸟枪文库质粒的原始数据输入在RedHat Linux平台的并联计算机群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所测序列，构建亚克隆并测序以填补出现在序列之中的缺口，得到一段连续的盐藻基因组序列；通过与其cDNA序列的比对，在该连续的盐藻基因组序列中，获得盐藻26S蛋白酶体亚基RPT2基因的全长基因序列。