[发明专利]遗传改良大豆品系GTS40－3－2检测用标准质粒分子及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程技术领域的质粒分子，具体来说，涉及一种遗传改良大豆品系GTS40-3-2检测用标准质粒分子及其构建方法。

背景技术

基因工程技术的出现和应用为农业、医学等领域开辟了一个全新的发展时代。1994年，Calgene公司利用基因工程技术研制的遗传改良番茄品系“FLAVR SAVR”在美国首次被批准进入商业化生产。到2006年，全球遗传改良作物种植面积已达1亿多公顷。与此同时，大量的遗传改良农产品涌入我国市场。我国农业转基因生物安全管理办公室于2004和2005年分别为境外18种遗传改良作物颁发了安全生产许可证，以用于进口加工原料，其中包括遗传改良大豆品系GTS-40-3-2。随着遗传改良作物的广泛种植，其安全性问题引起了全球公众的普遍重视，国际组织和国家纷纷制定相应的安全管理法规，加强遗传改良作物的规范管理，并对遗传改良植物及其产品实施标识制度。

为了应对遗传改良作物管理相关的法律法规和制度，建立高效、快速、特异的检测技术十分必要，它是各国际组织和国家管理遗传改良作物的有力技术支撑。基于核酸的聚合酶链反应(PCR)检测技术因具有高灵敏度和特异性强的优点，已成为目前最重要、应用最广泛的遗传改良作物及其产品检测技术。PCR检测方法建立的主要依据是特异性的扩增遗传改良植物的外源基因片段。针对扩增的外源DNA片段差异，PCR检测策略可以分为四种，即通用元件筛选PCR检测、基因特异性PCR检测、构建特异性PCR检测和品系特异性PCR检测。品系特异性PCR检测是通过检测外源插入载体与植物基因组的连接区序列实现的。由于每个遗传改良作物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是单拷贝的，因此品系特异性检测方法具有较筛选、基因特异性和构建特异性PCR检测方法更高的特异性和准确性，能够特异的检测专一的遗传改良作物品系。目前品系特异性PCR检测方法已成为各国研究的重点。

在实际检测中，标准物质十分重要。然而，由于专利权和现有技术的限制，遗传改良作物标准物质的获得相对较难，其缺乏已成为检测方法建立和应用的瓶颈，阻碍了转基因产品标识制度的顺利实施。并且，现有的标准物质都是利用遗传改良作物材料研制生产的，其难于保存，材料来源也比较有限，到目前为止仅得到十几种遗传改良作物的标准物质。

经对现有技术的文献检索发现，日本科学家Hino等在《Journal of AOACInternational》(国际官方农业化学家协会杂志)2002年第85卷第1077-1089页上发表的“Novel Reference Molecules for Quantitation of GeneticallyModified Maize and Soybean(用于遗传改良玉米和大豆定量检测的新型标准分子)”，该文中提出利用质粒标准分子代替标准物质用于遗传改良作物检测的理念和方法，并构建了含有外源检测目的片段和内源标准基因的质粒分子，成功的用于遗传改良大豆和玉米的检测。经验证标准质粒分子是很好的标准物质替代物，具有基因组制备容易、扩增效率高和稳定性好的优点。然而，其不足之处在于该质粒分子是针对外源目的基因片段构建的，只能用于遗传改良作物的基因特异性检测，与检测方法发展的趋势相脱节，因此不能满足转基因产品标识制度的要求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种遗传改良大豆品系GTS40-3-2品系特异性检测用标准质粒分子及构建方法，使其可以代替遗传改良大豆品系GTS40-3-2的阳性标准物质用于遗传改良大豆品系特异性的定性、定量PCR检测。根据遗传改良大豆品系GTS40-3-2的品系特异性序列和内标准基因序列，利用重叠PCR反应的原理设计特异PCR引物，经过PCR扩增获得遗传改良大豆品系GTS40-3-2的品系特异性序列和内标准基因Lectin一段序列的重组DNA片段。利用分子克隆技术将重组DNA片段克隆到pMD18-T载体中，获得新的质粒分子pMD-RRS。本发明构建的标准质粒分子可代替遗传改良大豆品系GTS40-3-2原有的阳性标准物质，用于定性和定量PCR检测，彻底解决遗传改良大豆品系GTS40-3-2检测中标准物质缺乏的难题。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明所述标准质粒分子，以替代遗传改良大豆品系GTS40-3-2的阳性标准物质，用于定性和定量PCR检测。该标准质粒分子同时含有遗传改良大豆品系GTS40-3-2的品系特异性序列和内标准基因Lectin的一段序列。