[发明专利]一种抗体亲和层析纯化溶葡萄球菌酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶的纯化方法，具体的说涉及溶葡萄球菌酶的层析纯 化方法。

背景技术

溶葡萄球菌酶(Lysostaphin)是Staphylococus Simulans葡萄球菌分泌于胞 外的蛋白产物，分子量为27kDa，含246个氨基酸，是一种肽链内切酶。 该酶可切断葡萄球菌细胞壁肽聚糖中的五甘氨酸肽键桥结构，从而达到迅 速溶解并杀死细菌的目的。即使是耐药性金黄色葡萄球菌，MRSA及“超级 细菌”，溶葡萄球菌酶也同样有很强的杀菌作用，而且不容易诱导产生耐药 菌株，有望成为治疗耐药性细菌感染的新型生物制剂。

1987年复旦大学在球形芽孢杆菌中表达溶葡萄球菌酶获得成功，并建 立了该酶的分离纯化方法，该方法包括使用DEAE纤维素的阴离子层析以 及CM纤维素的阳离子层析，由于层析介质刚性弱、蛋白载量低，导致层 析过程流速不能太快、只能处理小体积样品，处理10升样品需要4天的时 间，而且在得率、纯度等方面都不理想。

申请人构建了一种从含溶葡萄球菌酶基因的球形芽孢杆菌培养上清中 纯化溶葡萄球菌酶的技术(专利公开号：CN1743453；公开日：2006.3.8)， 该方法包括离子交换和疏水层析，处理45升样品只需2个工作日，总回收 率为50％，比活性达到1000U/mg蛋白质，但此方法只适用于工业化的大 生产，生产所得的溶葡萄球菌酶纯度达到90％左右，尚不能满足药用的纯 度要求。

另外，申请人构建了一种用大肠杆菌高效外分泌表达溶葡萄球菌酶的 工艺(专利公开号：CN1900290；公开日：2007.1.24)，符合新药申报的药 用工程菌的要求，表达产物以最终的成熟溶葡萄球菌酶活性形式存在于培 养基中，无包涵体复性等步骤；纯化较简单，宿主菌蛋白污染少；回收率 高，表达量可以达到200-400mg/L，回收率大于60％，但所得的溶葡萄球菌 酶纯度也无法达到药用的要求，需要更进一步的纯化。

亲和层析法是依据生物大分子能够与配体特异、可逆地结合在一起的 特性，从复杂的生物样品中分离得到所需目标产物的分离纯化方法。它基 于生物大分子与配体之间的生物学特异性，具有选择性强、纯化效率高、 步骤简单，为近年来各类蛋白纯化的主要研究方向，部分研究者也尝试用 亲和层析法纯化溶葡萄球菌酶：如用Sepharose4B作为亲和吸附剂，用金 黄色葡萄球菌的死菌体细胞和细胞壁肽聚糖作为配体进行的亲和层析(张 培德，马力，陈石根.葡萄球菌酶的亲和层析.工业微生物，1992，21(5)：1-5)。 有采用壳聚糖作为载体，与酶作用的特异底物(细菌菌体细胞)固定化，作为 吸附介质纯化溶葡萄球酶(周毅彬，张培德.工业微生物.2002，332(1)： 19-22)。也有以金黄色葡萄球菌细胞壁肽聚糖(PG)偶联于BrCN活化的 Sepharose4B为亲和吸附介质用以纯化溶葡萄球菌酶(张培德，马力.工业微 生物.1992，5:1-5)。但以菌体细胞或细胞壁肽聚糖作为配体制得的亲和吸附 柱柱效很短，使用2—3次后就基本丧失亲和作用，且吸附量较低，无法应 用于工业化生产。

因此寻找一种专一性好、产品纯度高、样品吸附量大的溶葡萄球菌酶 纯化工艺是有关领域十分迫切需要解决的难题。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是公开一种抗体亲和层析纯化溶葡萄球菌 酶的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明的方法包括如下步骤：

(1)溶葡萄球菌酶抗体的处理：

将含有溶葡萄球菌酶抗体的样品通过预先用0.05～0.2mol/L pH7.0-9.0 的缓冲液A平衡好的装有protein A树脂的层析柱，然后用0.05～0.2mol/L pH7.0-9.0的缓冲液A清洗上样后的protein A层析柱；再用0.05～0.2mol/L pH2.0～4.0的缓冲液B以每分钟1～4ml的流速，将溶葡萄球菌酶抗体从层析 柱上洗脱并收集洗脱峰，冻干，获得溶葡萄球菌酶抗体冻干产物；

含有溶葡萄球菌酶抗体的样品中，溶葡萄球菌酶抗体的含量为0.1～3 ％，每ml的protein A树脂可以纯化1-50mg的溶葡萄球菌酶抗体样品。

所说的溶葡萄球菌酶抗体样品的制备方法参照公开出版物[(美)J.萨 姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南(第二版).第十 八章，第一节，PP853-858.科学出版社.1992]；