[发明专利]利用差速消化实现细胞高度富集的方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及利用差速消化法纯化制备细胞的方法和用途。

背景技术

从外周血、骨髓、外周淋巴器官或各种组织分离出来的细胞是多种细胞的混合物，如要研究某种特定细胞的结构、功能或表面标志等特征，首先要分离纯化细胞。细胞纯化可根据其大小、密度、表面荷电、吸附能力或表面抗原的差异而采用密度梯度沉降法、细胞电泳、贴附、亲和层析、花环形成、补体介导杀伤溶解以及流式细胞仪(FCM)等方法来进行纯化。尤其在组织工程领域，对细胞纯度、数量的要求很高，而上述列举的方法具有耗时、操作烦复不易掌握、设备试剂昂贵等缺点。

以雪旺细胞(Schwann cell，SC)为例，说明目前尚不能利用现有技术制备高纯度的SC。

SC起源于神经脊细胞，在成体的周围神经组织中包绕所有神经轴突纤维，并可分为两种类型：一种包绕有髓纤维形成髓鞘，另一种包绕无髓纤维但并不行成髓鞘；每个形成髓鞘的SC只包绕一根轴突纤维，而不形成髓鞘的SC可包绕多根无髓轴突纤维。形成髓鞘的SC相当于中枢神经系统中的少突胶质细胞(oligodendrocyte)，而不形成髓鞘的SC则相当于中枢中的星形细胞(astrocyte)。

SC不仅在周围神经的发育和功能维持中发挥着重要功能，更在周围神经的损伤再生中起着重要作用。在周围神经损伤后，损伤位点远侧的神经组织发生瓦勒变形(Wallerian degeneration)，其内的SC去分化为不成熟的SC(immature SC)并分裂增殖，形成Burger氏带，吞噬轴突碎片并分泌神经营养因子及细胞外基质(ECM)，刺激并诱导再生轴突的定向延长。

SC的体内外研究及组织工程化人工神经的构建都需要制备高纯度的SC。然而在SC的体外培养中，成纤维细胞的优势生长严重影响了培养所获得的SC纯度。在过去的30年，诸多研究者报道了多种纯化SC的方法，可归纳为下列几种：(1)抗有丝分裂处理，(2)抗有丝分裂处理结合抗体介导的细胞裂解法，(3)重复植块法，(4)差速贴壁法，(5)免疫选择法。然而这些方法各有其缺点存在。抗有丝分裂剂，如阿糖胞苷等，非特异地作用于所有的进行有丝分裂的细胞，因而不仅减少了快速增殖的成纤维细胞，同时也杀死了处于有丝分裂期的SC；而抗体介导的细胞裂解则需要价格昂贵的抗体及补体；重复植块法及差速贴壁法操作过程复杂且容易在纯化过程中丢失大量的SC；免疫选择法，无论是采用流式分选还是磁珠分选均需要采用特殊的设备及抗体，操作过程即不经济也不方便，细胞丢失量也较大。

因此，在本领域迫切需要一种方法简单、快速、经济且安全的细胞纯化方法。

发明内容

本发明旨在提供一种富集细胞的方法。

本发明的第二个目的是提供一种富集SC的方法。

本发明的第三个目的是提供一种富集内皮细胞的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种获得细胞的方法，它包括步骤：

(a)将贴壁培养的细胞群与蛋白酶混合，从而使待分离的细胞从贴壁细胞群上脱落下来，成为游离的待分离细胞，其中所述的贴壁培养的细胞群含有待分离的细胞以及待弃的细胞；所述的待分离的细胞和待弃的细胞是不同的细胞；

(b)将游离的待分离细胞与所述的细胞群分开，从而获得待分离的细胞。

更佳地，本发明提供了一种富集细胞的方法，它包括步骤：

(a)将贴壁培养的细胞群与蛋白酶混合，从而使待分离的细胞从贴壁细胞群上脱落下来，成为游离的待分离细胞，其中所述的贴壁培养的细胞群含有待分离的细胞以及待弃的细胞；所述的待分离的细胞和待弃的细胞是不同的细胞；

(b)将游离的待分离细胞与所述的细胞群分开，从而获得待分离的细胞。

在另一优选例中，所述的待分离的细胞和待弃的细胞具有不同的脱壁时间，所述的脱壁时间相差5min-36小时。

在另一优选例中，所述的细胞群含有雪旺细胞(Schwann cell，SC)和成纤维细胞。

在另一优选例中，所述的细胞群含有内皮细胞和成纤维细胞。

在另一优选例中，在步骤(b)后还包括步骤：

(c)用待分离细胞或待弃细胞重复步骤(a)、(b)，得到富集的待分离细胞或待弃细胞。

在另一优选例中，重复步骤(a)、(b)1-5次。

在另一优选例中，重复步骤(a)、(b)1-2次，更佳地，重复3次。

在本发明的第二方面，提供了一种富集SC的方法，它包括步骤：