[发明专利]生产谷胱甘肽的毕赤酵母基因工程菌及用于构建其的重组质粒

说明书

技术领域

本发明涉及生物发酵合成谷胱甘肽领域，特别涉及一种生产谷胱甘肽的毕赤酵母基因工程菌及用于构建其的重组质粒。

背景技术

谷胱甘肽(GSH)以其多方面的生理功能而广泛涉及酶学、转运、药理、毒理、治疗、内分泌、微生物学及农业等研究领域，特别是在医药、食品行业对其需求量大。从上世纪80年代开始至今，发酵法一直是工业化生产谷胱甘肽的主要方法。

目前生物发酵合成谷胱甘肽是以啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的发酵为主。研究表明，谷胱甘肽的生物合成包括由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH I，EC6.3.2.2)与谷胱甘肽合成酶(GSH II，EC6.3.2.3)组成的谷胱甘肽合成酶系在ATP存在下催化L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸的序贯反应合成，此为基因工程改造谷胱甘肽产生菌提供了依据。例如：EP0300168公布将谷胱甘肽合成过程的两个酶GSH I和GSH II的基因克隆至啤酒酵母基因组可提高酵母合成谷胱甘肽的能力；JP8070884披露通过将某一耐过氧化物啤酒酵母的抗氧化基因克隆并导入啤酒酵母SHY-2可使谷胱甘肽的产量提高2.5倍；JP2004173503公布将汉森多型酵母的GSH I基因重组至表达载体并转化谷胱甘肽合成缺陷菌生产谷胱甘肽；US20050239164A1公布结合重组技术和传统诱变方法获得突变基因明确的高表达GSH I及GSH II的亮氨酸缺陷型啤酒酵母在含肌醇的培养基及促进产量的培养条件下生产分泌型谷胱甘肽的方法；CN1699552公开了一种啤酒酵母工程菌及其构建方法。该工程菌将经过改造的GSH I基因导入酿酒酵母YSF-31中，得到的高谷胱甘肽低双乙酰含量菌株，可相对缩短发酵周期且在该专利发明人另文发表的文章中(Xiuying Fan et al.Biotechnology letters 26：415-417，2004)，应用此菌株发酵后所得谷胱甘肽含量可达到13.1mg/g干细胞重量。但是在啤酒酵母发酵过程中，所产生的乙醇会对啤酒酵母的生长产生抑制作用而导致啤酒酵母很难高密度培养，即啤酒酵母不能以极高密度生长，且发酵周期长降低了发酵质量，增加了发酵成本。

发明内容

本发明要解决的技术问题即是克服上述现有技术缺陷，提供一种可以高密度培养、高产GSH、降低发酵成本的谷胱甘肽产生菌，具体来说，是一种生产谷胱甘肽的毕赤酵母(Pichia Pastoris)基因工程菌，以及用于构建其的重组质粒。

为提高GSH产量、降低发酵成本，本发明人考虑不局限于构建啤酒酵母的工程菌来单纯地提高其表达量，而拟另辟蹊径，选用其它与啤酒酵母不同种属的发酵菌来进一步研究。其中，毕赤酵母(P.Pastoris)作为一种真核表达系统现公认具有如下特性：①P.pastoris具有旺盛的生长力，可以在廉价的非选择性培养基中快速生长，培养液的组分价廉便于工业化生产；②P.pastoris偏爱有氧生长，有较宽的生长pH适应范围(3.0-8.0)，对发酵过程中产生的乙醇具有耐受性，有较好的发酵基础，非常有利于实现高密度发酵培养，菌体密度可高达100g干细胞/L发酵液(Romanos M A，Scorer C A，Clare JJ.Yeast，1992；8：423-488)。上述特性，特别是特性②使得毕赤酵母具备以极低成本生产胞内代谢产物的能力。然而野生型毕赤酵母胞内谷胱甘肽含量很低，需进行基因工程改造，构建毕赤酵母的基因工程菌，才使其投入工业应用成为可能。

因此，本发明拟用外源性的，如来源于啤酒酵母的谷胱甘肽合成酶系GSH I和GSH II的基因gshI和gshII整合至毕赤酵母的基因组来构建高产GSH的毕赤酵母基因工程菌。由于毕赤酵母没有天然的质粒，因此所有外源基因都需要通过表达载体同源重组至其基因组才可在此宿主表达，而构建好的外源基因也就是质粒在重组前需要用内切酶线性化。因此，为构建生产谷胱甘肽的毕赤酵母基因工程菌，首先需制备用于构建该基因工程菌的重组质粒。

在构建重组质粒时，由于像酵母这样的真核表达系统是不共用启动子和终止子的，即各个基因需独立携带各自的启动子和终止子。因此本发明一种用于构建生产谷胱甘肽的毕赤酵母(P.pastoris)基因工程菌的重组质粒，其包括两组适于毕赤酵母表达系统的启动子和终止子，以及筛选标记和线性化位点，其中该两组启动子和终止子之间分别插有外源性的谷胱甘肽合成酶系GSH I和GSH II的基因gshI和gshII。