[发明专利]一种从生物组织样品中分离RNA的试剂及其从生物组织样品中分离提取RNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从生物组织样品中分离RNA的试剂。本发明还涉及用该试 剂从生物组织样品中分离提取RNA的方法。

背景技术

核酸是一种大分子遗传物质，包括DNA和RNA。近年来，在基因研究的 相关技术中，已越来越多的以RNA为研究对象，细胞中RNA的提取和纯化是分子 生物学技术中的重要步骤，对人类的基因组学和蛋白组学的研究有重要意义，只 有纯度高、完整性好的总RNA才可用于Northern杂交、mRNA纯化、构建cDNA 文库、通过RTP-CR分离基因以及蛋白质体外翻译等进一步实验操作。因此保证 RNA的纯度和完整是实验的关键。由于RNA极易被广泛存在的RNA酶降解，在实 验中如何防止RNA酶的污染和抑制RNA酶的活性是需要解决的重点问题。

有关动植物组织中RNA提取方法的报道已很多。RNA的提取目前阶段主要可 采用两种途径：其一是提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来。其二是直接在 酸性条件下抽提。另外硫氰酸胍/热酚法(guanidinium/hot phenol method) (Feramisco etal.1992)，氯化胍法guanidinium chloride(COX1968)，氯 化锂/硫氰酸胍法，氯化铯/异硫氰酸胍法等都可以有效的分离提取RNA。它是先 将组织或细胞用含有胍类等强烈蛋白质变性剂的变性液处理后，再根据蛋白质、 DNA及RNA的分子量不同，在氯化铯、氯化锂等溶液中进行梯度离心，沉淀得到 RNA。但是这些方法操作复杂，操作时间长达24小时以上，而且多次沉淀也会导 致RNA的产量大大减少。并可能造成小分子量RNA的丢失。目前普遍采用的是根 据DNA和RNA在酸性酚溶液中的溶解度不同，组织或细胞用变性液处理后，再用酸 性酚和氯仿抽提的酸性硫氰酸胍—酚—氯仿一步法(又称为“一步法”或 acid-guanidine-phenol-chloroform AGPC法)，该方法的优点是有强烈的蛋白 变性剂，它能强烈抑制材料及提取液中的Rnase的活性。收获的非降解RNA产量 大、纯度高，不需超速离心或多步酚—氯仿抽提，抽提时间缩短至4小时，得到 广泛的应用，并有成熟的产品(Trizol等)供应。但在提取组织，尤其是从富含蛋 白质组织中抽提RNA时，往往蛋白质抽提不净，影响RNA质量，而且Trizol试剂价 格昂贵。改进的SDS-Phenol法，经比较证实该方法比AGPC法优越，RNA纯度略 高于AGPC法，且该法操作简单，全程只需要两小时，无需超速离心和多次酚- 氯仿抽提。但是同样无法较好的解决杂质多，不溶物多，酚类物质去除不彻底的 问题，氧化的多酚能与RNA稳定结合，不利于下游技术的使用。

中国专利申请971083665公开了一种总RNA提取试剂以及提取总RNA的方 法。该提取试剂以异氰酸胍、盐酸胍两种RNA酶的高效抑制剂为主要原料，以十 二烷基硫酸钠，十二烷基肌酸钠两种为去垢剂，柠檬酸三钠、乙酸钠、冰醋提供 盐分和调节pH值，以消毒双蒸水和苯酚作为溶剂来制备的，其中抑制剂的重量 百分浓度为16—65％，去垢剂浓度为0。2—0。7％，消毒双蒸水10—35％，苯酚 为12—46％，pH调节剂0。005-0。02％。该专利申请中还公开了使用其提供的RNA 提取设计提取总RNA的方法。该方法由下列步骤组成：1)先用该提取试剂预处 理样品；2)用萃取剂氯仿和异戊醇萃取；3)离心分离后，取上层水相加入异丙 醇在萃取；4)离心分离后获得白色沉淀即是总RNA。5)还可以用酒精进行洗涤 并干燥。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取效果好，成本低的从生物组织样品中分离RNA 的试剂，同时，提供一种改进的从生物组织样品中分离提取RNA的方法。

本发明提供的从生物组织样品中分离RNA的试剂，包括RNA抑制剂，去垢 剂，pH调节剂，还加入了聚乙烯吡咯烷酮，其浓度为1—3％(m/V)；上述溶液 中再加入等体积的酸性水饱和苯酚和1/5体积的2M乙酸钠混匀；pH为3.2— 3.8。

本发明中聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可以有效地去除多糖、多酚，减轻了这些 物质对下游RT-PCR反应的抑制作用。

根据本发明的实施例，该分离试剂中RNA抑制剂采用异硫氰酸胍，加入加 入苯酚和乙酸钠之前的浓度为4M。