[发明专利]固态发酵微生物总DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA提取方法，具体涉及固态发酵中微生物总DNA提取方法。

背景技术

固态发酵是指利用自然底物做碳源及能源，或利用惰性底物做固态支持物，其体系无水或接近于无水的任何发酵过程，微生物的生长及所形成的产物均在基质的表面。随着能源危机与环境问题的日益严重，固态发酵技术以其特有的优点(如无“三废”排放)引起人们极大的兴趣；同时充分开发利用固态发酵这一技术来生产人们所需发酵产品，已受到世界各国科技工作者的关注；而微生物在固态发酵过程中扮演十分重要的角色。因此，研究固态发酵中微生物的生物多样性和菌落演替情况，将有助于我们更深入地了解固态发酵发生的机理，从而更好地实现对其技术的控制和优化。

目前，研究固态发酵样中微生物菌落的多样性以及菌落演替主要运用传统的显微镜法、平板法和biolog法，而这些方法都借助于微生物培养法，这必将导致失去很多非培养性物种信息，从而使研究不全面。然而建立在分子生物学技术上研究微生物菌落的多样性以及菌落演替，克服了微生物的不可培养性，为研究固态发酵样中微生物菌落的多样性以及菌落演替提供了新的途径。

在大多数的分子生物学技术的研究中，关键在DNA的提取。目前用于DNA提取的方法很多，但主要集中于细菌DNA的提取，相对比较简单。但是可以同时提取细菌、放线菌、真菌DNA的方法却比较罕见。因此，寻找一种可以同时提取细菌、放线菌、真菌DNA的方法，对于固态发酵样中全面了解这三种菌的菌落变化是非常必要的。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供了一种可以同时提取细菌、放线菌、真菌DNA的方法，以全面了解固态发酵样中微生物的多样性，从而更好的发挥微生物资源在固态发酵中的应用。

本发明的目的通过以下方案实现：

一种固态发酵微生物总DNA提取方法，包括以下步骤：

a.样品的洗涤：固态发酵样须用0.1M磷酸盐缓冲液洗涤三次；

b.DNA的提取：往上述洗涤后的固态发酵样中加入异丙醇，用超声波冰浴超声，样品破碎以后，高速离心至样品完全沉淀，去上清液；往沉淀中加入十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)抽提液，65℃水浴完全反应后，加入等体积的氯仿-异戊醇，高速离心至沉淀完全，并回收水相；在回收水相中加入1/10体积的CTAB-NaCl溶液，65℃水浴待完全反应后，加入等体积的氯仿-异戊醇，再高速离心至沉淀完全，并回收水相；在回收水相中加入0.6倍体积的预冷异丙醇，并在-20℃放置待充分反应后，再高速离心至沉淀完全，去上清液；沉淀用预冷的乙醇重复洗涤和干燥，干燥后的沉淀溶于TE缓冲液中，得到粗提DNA；

c.DNA的纯化：上述粗提的DNA经纯化试剂盒纯化以后，在其纯化产物中加入核糖核酸酶，37℃水浴消化，以除去RNA。

所述每1g固态发酵样中加入异丙醇4mL，所述超声过程中破碎5.2s，停2.4s，振幅45％，所述氯仿-异戊醇体积比为24∶1，所述每1g沉淀中加入CTAB抽提液1000μL，所述加入的CTAB抽提液中还含有体积百分数为2％的β-巯基乙醇，所述CTAB-NaCl溶液组成为：10mg/mL CTAB；0.7mol/L NaCl，所述异丙醇、氯仿、异戊醇质量分数均＞99％，所述加入的核糖核酸酶终浓度为0.5μg/mL。

本发明的优点是：目前，对于环境样品的分子生态学的研究主要集中于细菌的DNA提取以及后续的研究。而环境样品中微生物种类是非常丰富的，仅对其中的细菌菌落进行多样性分析是不够的，也要对其他几类菌以及相互作用进行分析。因此有必要寻找一种能获得真实反映原环境样品中微生物实际组成状况的总DNA的方法，并随后可利用于酶切、连接、PCR和梯度凝胶电泳以及建立克隆文库和DNA序列测序，从而获得全面的微生物遗传信息。本发明针对固态发酵过程是多类微生物共同作用的过程，提供了一种可以同时、全面研究真菌、细菌、放线菌的动态变化以及其种类多样性的途径。此方法可同时成功的提取固态发酵样中细菌、放线菌、真菌的总DNA并能获得较高、较纯的DNA产量，且均能成功的扩增出细菌、放线菌、真菌的目的条带和获得相当高产量的PCR产物，并可用于后续遗传多样性等分析。是一种快捷、比较经济适用的固态发酵样微生物总DNA提取的方法。此外本法不需要特别的仪器，实验成本相对较低。因此本方法为研究固态发酵样的分子生态学研究提供了一种快捷，经济的方法。

附图说明

图1：粗提以后和纯化以后的固态发酵样总DNA的琼脂糖凝胶电泳图；