[发明专利]一种高效表达病毒基因dsRNA的载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种载体，具体涉及高效表达病毒基因dsRNA的载体。

背景技术

植物病毒作为一类侵染植物的主要病原物，在全世界范围内引起农作物、果树、花卉、牧草、药用植物的病害，造成产量和品质的下降，甚至形成毁灭性危害。据不完全统计，全世界每年因植物病毒病害所造成的产量损失就大约占粮食总产量的10％。但目前生产上仍无有效的防控方法。

RNA沉默(RNA silencing)是指发生在RNA水平的基于核酸序列特异性的相互作用来抑制基因表达的一种调控机制，这种机制广泛存在于真核生物中，包括真菌、藻类、植物、原生动物、无脊椎动物和脊椎动物等(Agrawal N，Dasaradhi PVN，Mohmmed A，Malhotra P，Bhatnagar RK，and Mukherjee SK.RNA interference：bilology，mechanism，and applications.Microbiol Mol Biol Rev 2003，67：657-685)，也是植物固有的一种对抗病毒侵染的普遍防卫反应(Baulcombe D.RNA silencing in plants.Nature 2004，431：356-363)。病毒在自然侵染下能诱导植株的RNA沉默，而且它能通过特定序列信号传导到临近细胞(短距离)和整株植物(长距离)。植物中的RNA沉默具有适应性广，能移动和序列特定的特点。RNA沉默现象的发现为设计新的植物病毒防治方法提供了新的可能。

目前RNA沉默已经广泛应用于基因功能研究、动物病毒病的防治和人类病毒的治疗(Dykxhoorn DM and Lieberman J.Silencing Viral Infection.PLoS Med 2006，3：1000-1004)，与RNA沉默应用于动物病毒的防治相比，基于RNA沉默的植物病毒防治的研究进展缓慢，近年来才引起科学家的重视。植物病毒和动物病毒有很多共性机制(如复制过程)，借鉴动物病毒的研究方法和体系，对利用RNA沉默防治植物病毒的关键问题进行研究，是植物病毒防治的新思路，也必将成为植物抗病毒工程研究领域的热点(Tenllado F，LlaveC，and Diaz-Ruiz JR.RNA interference as new biotechnological tool for the control ofvirus disease in plants.Virus Res 2004，102：85-96)。

近年来，已有一些研究小组开始利用RNA沉默机制来进行植物抗病毒研究。有两条途径可实现dsRNA的大量表达，从而诱导植物抗病毒RNA沉默机制的启动。1、构建表达病毒基因dsRNA的转基因植物；2、离体表达病毒基因dsRNA。因为表达dsRNA的转基因植物不表达蛋白质，这既提高了转基因植物的抗病性，又避免了人们对转基因植物安全性的顾虑。理论上，病毒基因组上的任何基因都可以用来构建能表达dsRNA的载体进行植物基因转化，并通过该机制使转化植物对相关病毒产生抗性。但由于大部分农作物的转化体系不成熟，利用构建表达dsRNA载体进行植物基因转化获得的抗病毒转基因植株被成功应用生产的实例并不多。而且由于作物一般均遭受多种病毒复合侵染危害，必须将不同病毒的dsRNAs转入寄主植物才能获得抗多种病毒的转基因植物，而这在遗传学上是很难实现的。

借鉴动物中所用的外源dsRNA沉默基因方法，利用离体表达的病毒基因dsRNA诱导植物RNA沉默防治病毒病可避免上述诸多缺点。目前构建能表达病毒基因dsRNA的原核表达载体包括：1、构建含有该基因反向重复序列的载体；2、利用Timmons&Fire等构建含有两个方向相反的双向T7启动子的载体L4440(Specific interference by ingesteddsRNA.Nature，1998，395：854)。但两种方法生产dsRNA均需要通过诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导，而IPTG价格昂贵，限制其在农业生产上的进一步推广。

因此构建一种既能表达病毒基因dsRNA，又无需诱导剂的原核表达载体，是实现病毒基因dsRNA的离体高效表达，诱导寄主RNA沉默的关键技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能高效表达病毒基因dsRNA的原核载体，从而实现利用RNA沉默防治植物病毒病害。