[发明专利]一种检测WT1和MDR1基因异常表达的多重定量PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及用于诊断疾病的试剂盒，具体是用于诊断白血病的试剂盒，特别是利用荧光定量PCR诊断白血病的试剂盒。

背景技术

难治复发是导致急性白血病治疗失败的根本原因，目前研究发现某些基因和急性白血病的难治复发存在密切关系，其中最主要的有人类多药耐药基因MDR1基因和Wilm’s瘤I型(WT1)基因，MDR1基因所编码的P糖蛋白(P-gp)可将白血病细胞内药物泵至细胞外，降低细胞内药物蓄积，导致化学治疗的效果下降乃至消失。WT1基因是一种抑癌基因，定位于11p13，所编码的锌指蛋白是序列特异性转录调控因子，具有转录抑制和转录激活的双重作用，研究发现MDR1，WT1基因的异常表达均与难治复发白血病有关，而且发现这两个基因表达水平有明显的相关性，且与临床预后有关，目前关于WT1和MDR1异常表达与难治复发急性白血病关系的研究已成为国内外研究的热点。

目前国内外研究一般是对WT1和MDR1基因进行单独检测，并没有建立对WT1和MDR1基因同时进行检测的体系方法。国内有研究者用PCR分别扩增WT1和MDR1基因，通过琼脂糖凝胶电泳进行半定量分析，研究两种不同的基因在白血病临床耐药中的作用及相互关系，Galimberti S等人应用荧光实时定量PCR分别检测50例AML患者WT1和MDR1基因的表达水平，发现WT1和MDR1基因在表达水平上明显相关。但是，这些检测方法都是存下述缺陷：(1)国内多使用半定量的方法检测WT1和MDR1基因，不能准确地对这两个基因的表达水平进行定量，判断阳性、阴性带有一定的主观性；(2)国外应用Taqman探针法分别检测WT1和MDR1基因，虽能准确地对两者的表达水平进行定量，但是不同反应体系中不同干扰因素对MDR1和WT1基因扩增效率有不同的影响；(3)不同反应管存在加样误差而导致对同一样本MDR1和WT1基因定量结果受到影响。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可同管检测WT1和MDR1基因异常表达的多重定量PCR试剂盒，该试剂盒具有试剂用量少，大大地节约了成本，缩短检测时间的优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案是：

一种检测WT1和MDR1基因异常表达的多重定量PCR试剂盒，该试剂盒由定量PCR缓冲液，DNA聚合酶，标准品，检测WT1基因的引物和探针，检测MDR1基因的引物和探针组成，其特征在于：

(1)标准品是重组pMD18载体，其中的外源基因是WT1基因和MDR1基因；

(2)检测WT1基因的引物和探针的核苷酸序列分别是：

WT1-F：5-CCCAGGCTGCAATAAGAGATATTT-3(SEQ NO.1)，

WT1-R：5-GTGTGCTTCCTGCTGTGCAT-3(SEQ NO.2)，

WT1-探针：5-AAGCTGTCCCACTTA-3(SEQ NO.3)；

(3)检测MDR1基因的引物和探针的核苷酸序列分别是：

MDR1-F：5-CAAGATCCTCCTGCTGGATGA-3(SEQ NO.4)，

MDR1-R：5-GAACCACTGCTTCGCTTTCTG-3(SEQ NO.5)，

MDR1-探针：5-ACGTCAGCCTTGGAC-3(SEQ NO.6)。

上述检测WT1基因的探针和检测MDR1基因的探针分别标记有不同的标记物，这些标记物可以是VIC、FAM等；定量PCR缓冲液为常用的或商业化的定量PCR buffer，如PCR buffer(5×)，其成分为：10 mM Tris-HCl(pH8.0)，50mM KCl，2mM MgCl₂。。

本发明所述的标准品的可由以下方法制备得到：

用RT-PCR法从K562细胞的总RNA中逆转录扩增WT1和MDR1的cDNA；通过BamHI，BglII酶切后连接成WT1+MDR1重组片断，并对其进行PCR扩增，扩增产物纯化后将其与pMD18载体进行连接，转化宿主菌DH-5α，然后提取重组质粒DNA，即可。

本发明试剂盒检测白血病患者WT1和MDR1基因异常表达是通过多重荧光实时定量PCR实现的，即WT1基因和MDR1基因的扩增是在同一反应管中进行，检测过程如下：