[发明专利]副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测试剂与方法，具体涉及一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法。

背景技术

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，简称VP)是一种广泛分布于海洋与盐湖中的嗜盐性细菌，海产品中常有此菌。食用了污染有副溶血弧菌的生的或者未煮熟的海产品时会导致严重急性肠胃炎，在细菌性食物中毒的构成中，又以副溶血弧菌引起的急性肠胃炎占首位。因此，快速灵敏的检测手段是预防控制副溶血弧菌传播的关键。通常传统鉴定方法是分离培养、镜检观察、生化鉴定、嗜盐性试验等，这些检测手段不仅耗时而且操作复杂、灵敏度低。近年来，有大量的报道证实基于PCR的方法已经成功用于检测副溶血弧菌，PCR方法在操作时间上以及检测的特异性和灵敏度方面较常规方法有较大提高，但是，PCR方法必须有精密的温度循环装置，它的检测时间也还是比较长(4～8小时)，并且反应过程很容易受污染物的影响，从而使得这种方法不能满足实地检测的需要。除了PCR方法以外，还有其他核酸扩增方法，比如核酸序列扩增法(NASBA)、自序列复制法(3SR)和链置换复制法(SDA)。这三种方法的检测水平都不少于10个拷贝，耗时1小时左右就可以将目标核酸扩增到相似的范围内，尽管如此，它们对目标序列的扩增特异性不强，使得扩增后还需要详尽的实验操作手段来检测扩增产物。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以，将生物技术发展的最新成果应用于病原微生物检测，具有重要意义。另外还有一些检测方法，比如免疫色谱法、DNA杂交法，虽然检测灵敏度高，但是所需设备和操作过程比较复杂，不能满足快速检测的需求。

DNA环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP)克服以往基因扩增方法的不足，在等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性。该方法通常是按如下步骤进行：步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA或RNA；步骤二、特异性引物的制备：确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；步骤三、进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应：将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与BstDNA聚合酶混合，在63～65℃保温0.5至1.5小时进行循环链置换反应；步骤四、分析判断反应产物结果。虽然已公开的LAMP技术具有高灵敏性，能在等温条件下高效地扩增核酸，但是现有技术也有不足之处，主要是：1.其特殊引物要求极为苛刻限制该方法的广泛应用；2.仅凭反应生成的乳白色沉淀物判断结果，不够清楚准确，也不易实现反应小型化，限制其进一步发展。为了克服这些缺点有必要对现有的LAMP技术进行改进。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法。

为达到本发明的目的，采用以下技术方案：

本发明的一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒，其试剂包括：

——引物混合液：四条引物浓度均为10pmol/μl，引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4；

——Bst DNA聚合酶：浓度为8U/μl；

——反应液：10mM dNTP∶10×ThermoPol反应缓冲液∶150mM MgSO₄＝8∶5∶2；

——样品预处理液：20mM Tris-HCl(pH 8.0)，2mMEDTA，1.2％TritonX-100；

——显色剂：荧光染料1×SYBR Green I；

——阳性对照为副溶血弧菌基因组DNA，阴性对照为不含模板的反应混合液。

用上述试剂盒检测副溶血弧菌的方法包括以下步骤：

(1)待检副溶血弧菌DNA提取过程：取过夜培养的增菌液于离心管中，1000rpm离心2分钟，去上清；加入样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均匀；沸水中煮10分钟后立即置于冰上冷却10分钟；10000-12000rpm离心2分钟，上清即可作为待检副溶血弧菌DNA；其中增菌液与样品预处理液的用量比为5∶8；